乳腺肿瘤微环境中趋化因子的多靶点调控机制研究(乳腺肿瘤学 趋化因子与乳腺癌)

司趋化因子转录后调节的广谱高效非典型性趋化因子受体

趋化因子及其受体所构成的网络在机体内可能受神经、激素、细胞因子、酶及结合蛋白等的综合调节。近年来，具有不同靶分子谱的非典型性趋化因子受体（atypical chemokine receptor，ACR）如Duffy抗原趋化因子受体（Duffy antigen receptor forchemokines, DARC）、D6和CCX-CKR的发现表明，体内的确存在趋化因子的转录后调节机制。这些不下传信号的趋化因子结合蛋白（non-signaling chemokine-binding protein, CKBP）如ACR[也被称为非典型性趋化因子结合物（atypical chemokine binder, ACB）]、诱饵受体（decoy receptor）、沉默受体（silent receptor）、清除槽（sink）、清道夫（scavenger）或内化受体（intereceptor），对趋化因子的转录后调节因广谱高效而引人注目，可能在体内趋化因子网络平衡的调控中发挥至关重要的作用。

DARC、D6和CCX — CKR在乳腺癌中发挥负性调节作用

1993年，Horuk等确认Duffy抗原也是红细胞膜上能够结合CXC和CC趋化因子的杂性趋化因子受体。对DARC具有高度亲和力的趋化因子包括CXC族趋化因子CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL7和CXCL8，CC族趋化因子CCL2、CCL5、CCL7、CCL11、CCL13、CCL14和CCL17等。DARC是一种集红细胞血型抗原、疟原虫入侵红细胞的辅助受体、HIV入侵T细胞的辅助受体、广谱趋化因子清除槽等作用于一身的多功能分子，其活性受基因多态性影响，也可能作为趋化因子的转运、呈递者而存在。2002年，Lentsch基于红细胞DARC阴性率占70%的男性非洲裔美国人前列腺癌发病率比白种人高60%、死亡率高1倍的流行病学资料，指出红细胞DARC的缺乏及ELR阳性CXC族趋化因子清除障碍可能与美国黑种人男性前列腺癌多发和病变较重有关。迄今DARC在实体肿瘤中作为负性调节因子的假说在肺癌、前列腺癌和黑色素瘤中已经得到一些实验研究资料的支持。如2004年，Addison等观察到经DARC基因修饰的人肺癌细胞A549在裸鼠体内的移植瘤虽较大，但伴有明显的细胞数目减少和坏死。2006年，Lentsch等观察到DARC基因剔除小鼠诱发的前列腺癌生长迅速，其瘤体可达野生鼠的4倍之多。2007年，Horton等观察到DARC可抑制小鼠黑色素瘤的生长和血管生成，其作用恰与CXCR2相反。与此同时，我们观察到过表达DARC可抑制人乳腺癌细胞裸鼠移植瘤的生长和肺转移；乳腺癌患者的DARC表达与淋巴结转移、微血管密度成反比，而与总生存率成正比。以253例良、恶性乳腺肿瘤患者为对象进行的红细胞Duffy血型与疾病关系的分子流行病学研究结果也显示，与Fya+b-和Fya+b+乳腺癌患者相比，Fya-b-和Fya-b+乳腺癌患者易于发生腋窝淋巴结转移，提示Fya的缺失可能促成乳腺癌的淋巴结转移。DARC的抗肿瘤作用不仅归因于其对成血管性趋化因子CXCL8、CCL2等的有效清除，还可能涉及广泛意义上的基因调控，如在前列腺癌中其抗肿瘤作用已被证实与前列腺癌转移抑制基因KAI1（抗癌1号基因）有关。

D6亦称为趋化因子结合蛋白2（chemokine binding protein 2，CCBP2）、趋化因子结会受体9（chemokine binding receptor 9, CMKBR9）、CC趋化因子诱饵受体1（CC chemokine decoy receptor 1, CCDR1）、CC趋化因子受体9（CC chemokine receptor 9, CCR9）或CCR10，具有典型的趋化因子受体结构即7次跨膜结构，其第2次跨膜区的改变即天冬酰胺替代了天冬氨酸，对D6的诱饵功能可能起着重要作用。D6高表达于肺、胎盘、小肠和皮肤淋巴管的内皮细胞。有人指出白细胞也表达D6，且白细胞可能作为D6的运载车（vehicle）。D6能结合几乎所有的炎性CC族趋化因子（CCL2～5、7、8、11～14和22，对CCL17也有较弱的结合能力），但它不结合内环境稳定性CC族趋化因子（CCR6～10的配基）以及其他家族的趋化因子。D6与配基结合后，细胞能迅速将配基内吞并降解。D6可抑制皮肤的炎症反应。Jamieson等剔除小鼠的D6基因，建立D6缺陷小鼠动物模型，用佛波酯诱导皮肤炎症反应并观察比较，结果显示D6缺陷小鼠与野生型小鼠相比，发生严重的炎症反应，出现大量的T细胞、肥大细胞以及多形核细胞浸润，伴有角化细胞增生、新生血管形成，形成牛皮癣样病变，该反应被证实是由于炎性趋化因子过度蓄积而引起的。Martinez de la Torre等在小鼠皮下注射完全福氏佐剂，发现前述D6缺陷小鼠的炎症反应明显严重并早于野生型小鼠，出现明显的坏死和血管生成。上述动物模型中，CC族趋化因子都明显升高，若预先给予鸡尾酒式趋化因子受体拮抗剂能抑制病变的进展，表明D6缺陷型小鼠的炎症反应增强与趋化因子系统失控有关。关于D6与肿瘤的关系，据报道在某些血管瘤细胞、PLT-2白血病细胞和绒毛膜癌（choriocarcinoma）细胞系可检测到D6蛋白。此外，在D6缺失小鼠可观察到佛波酯所致的皮肤肿瘤负荷增加，而D6转基因角化细胞则可抑制皮肤肿瘤形成。最近有人证实人类结肠癌可表达D6，D6缺失小鼠易患大肠炎症相关性癌症。最近，我们的研究证实D6也表达于乳腺癌，其表达水平与转移特性相关，过表达D6可显著抑制人乳腺癌裸鼠移植瘤的生长和肺转移。

继DARC和D6之后，1999年又发现了第3个诱饵受体ChemdCentryx趋化因子受体（ChemoCentryx chemokine receptor, CCX-CKR），又称为CCRL1或CCR11。CCX-CKR的配基包括CCL19、CCL21、CCL25和CXCL13。已经证实CCX-CKR可导致组成性趋化因子CCL19的连续内化和降解，提示其在调控趋化因子方面可能具有独特而重要的作用。Townson等在比较小鼠和人的CCX-CKR特征时发现，与大部分趋化因子受体不同，CCX-CKR在被其转染的人红白血病HEK293细胞中不能调节Ca2+流量，并且未发现配基诱导的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）的磷酸化。跨膜区天冬氨酸残基的缺失、第二个胞内环上标准基序DRYLAIN的改变可能是其不能介导胞内信号转导的主要原因。CCX-CKR mRNA表达于人类造血细胞和器官（树突状细胞、T细胞、脾、淋巴结等）、心脏、小肠和肺及新生小鼠脑胶质细胞。Kriegova等在肺结节病组和对照组的所有支气管肺泡细胞样本中都检测到CCX-CKR mRNA的表达，且观察到肺结节病组的CCX-CKR转录显著上调。CCX-CKR是一种新发现的趋化因子诱饵受体。我们在mRNA和蛋白质水平上首次证实多种人乳腺癌细胞系可表达CCX-CKR，但具有高转移特性的乳腺癌细胞系CCX-CKR的表达降低。同时，我们观察到在乳腺癌患者中CCX-CKR高表达者发生腋窝淋巴结转移较少，患者存活期较长。

虽然各种ACR具有不同的靶分子谱，如DARC只结合促血管生成性CXC和CC趋化因子，D6主要针对炎症性CC趋化因子，CCX-CKR的靶分子则是一些负责内环境稳定的趋化因子，然而在乳腺癌中的作用异曲同工，提示它们在趋化因子网络中可独立或协同发挥负性调控作用。值得一提的是，在CC趋化因子中有些（CCL2、5、7、11、13、14、17）受DARC和D6的双重调控，也有些（CCL4、8、12、22）只受D6的调控，其意义尚待阐明。我们新近的研究表明，DARC、D6、CCX-CKR在乳腺癌中似乎协同发挥负性调节作用。

evasins——独特的趋化因子结合蛋白

寄生于犬身上的褐色犬蜱是依赖于吸血的寄生虫，可传播诸如引起莱姆病的伯氏包柔螺旋体等病原体。研究发现，蜱能在宿主身上生活相对较长的时间，从几天至几周不等，若它们不携带特殊病原体而导致严重感染，就能安然吸血而不被宿主察觉，这是因为它们已经进化出了一种抗炎、抗凝血及止痛的颇为高明的策略，使宿主免疫系统按兵不动。Hajnicka等首次发现蜱唾液腺提取物可中和CXCL8、CCL2、CCL3、CCL5、CCL11、IL-2及IL-4等7种趋化因子或细胞因子。Deruaz等的研究也提示，蜱唾液中存在着能与CXCL8、CCL3及CCL5结合的分子，并成功分离出了唾液中可与趋化因子结合的蛋白，命名为evasin-1，证实其特异性地结合3种CC族趋化因子（CCL3、CCL4和CCL18）。与此同时，他们也克隆出了大小相近的两种新的趋化因子结合蛋白，分别是可与CXC族趋化因子CXCL1、CXCL8结合的evaisin-3和可与CC族趋化因子CCL5、CCL11结合的evasin-4。evasins为一类较小的分泌型趋化因子结合蛋白，其相对分子质量与多数趋化因子不相上下。分泌型evasin作为这种聪明寄生虫便于驻留吸血而平息宿主局部炎症反应的一种策略，是一类高效的广谱趋化因子灭活蛋白，这给了人们极大的遐想空间。evasins在体外实验中有潜在的趋化因子结合活性，在体内则呈现较强的抗炎活性。虽然迄今为止尚未在脊椎动物中发现分泌型的趋化因子结合蛋白，但蜱产生的evaisins的种属交叉性使其能够结合人类趋化因子，可望用作人类疾病的治疗手段。

趋化因子及其调节物在乳腺癌中的应用前景

2001年，Zlotnik等有关CXCR4参与乳腺癌肺转移的研究结果引起了极大的轰动，由此揭开了趋化因子学研究史上新的一页。CXCR4在乳腺癌中的阳性率高达60%，由于CXCR4也是HIV侵入T细胞的辅助受体，因此，以CXCR4为靶点的药物也许可以收到一箭双雕的效果。目前研究中的CXCR4拮抗剂异彩纷呈，既有经典的小分子拮抗剂AMD3100、AMD3465、AMD070、TN14003和CTCE9908，也有作用更为强大的肽类拮抗剂Pol 3026等。2009年，美国食品药品管理局（FDA）已经正式批准CXCR4拮抗剂AMD3100的注射液普乐沙福（Plerixafor）上市。CXCR4肽类拮抗剂CTCE-9908已被证实可抑制小鼠骨肉瘤和黑色素瘤的肺转移。抗CXCR4抗体在美国已经进入临床试验阶段，其适应证包括乳腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、黑色素瘤及淋巴瘤等，也许不久就可成为肿瘤生物治疗药物中的奇葩。然而，趋化因子及其受体为数众多，采用既往的单一靶点治疗策略可能并非所宜。临床上针对单一靶点的抗体、小分子拮抗剂、反义核酸、核酶、siRNA等往往效果有限。最近一些趋化因子受体拮抗剂临床试验的意外失败，强烈提示对趋化因子网络的多靶点调控尤其必要。所幸人工合成的多靶点肽类杂性趋化因子拮抗剂已经问世，其中BKT130可有效抑制6种趋化因子，包括3种CC趋化因子（CCL2、5、11）和3种CXC趋化因子（CXCL9～11）。

趋化因子是宿主调动并激活免疫效应细胞以控制和杀伤乳腺癌细胞的重要分子，但乳腺癌细胞也可利用趋化因子实现自身的生长、侵袭，乃至向特定器官的转移，且增殖期的乳腺癌细胞可以间接改变白细胞对趋化因子的反应性。因此，以整体观念、从分子生态动力学角度分析乳腺癌相关趋化因子及受体的作用，将有助于阐明趋化因子、肿瘤细胞与宿主之间的关系。相信不久的将来，随着三维体系多目标实时动态可视化分析技术的成熟，以及合成生物学的进步和对趋化因子组学（chemokinome）的纵横研究，有望找到顺应当代系统生物学和多向药理学（polypharmacology）趋势、基于趋化因子的高效和特异性乳腺癌防治的新途径。

（欧周罗）