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蛋白质组学与乳腺癌的发生发展、诊断、治疗及预后(乳腺肿瘤学 乳腺癌基因组学与蛋白质组学)

导语:蛋白质组学与乳腺癌的发生发展、诊断、治疗及预后属于乳腺肿瘤学下的乳腺癌基因组学与蛋白质组学分支内容。本篇围绕乳腺肿瘤学 蛋白质组学与乳腺癌的发生发展、诊断、治疗及预后主题,主要讲述乳腺癌,蛋白质组学等方面医学知识。

蛋白质组学与乳腺癌的发生发展

肿瘤的发生和发展是一个复杂的多阶段过程,是多种肿瘤相关基因表达失常或肿瘤抑制基因失活所致。正常基因的突变或缺失、癌基因的异常扩增和表达、多个基因的协同作用以及基因本身的多效性和机体免疫因素,最终决定基因表达和肿瘤表型。因此,毫无疑问,一个基因的研究方法,乃至任何仅依靠单一学科如细胞学、发育学、人类遗传学、肿瘤学、分子生物学或流行病学的独自努力,都难以揭示这种复杂的多因素疾病。

近年来,已有研究者从蛋白质组学角度,利用2-DE和质谱分析等技术去揭示乳腺癌发生发展过程中细胞蛋白质组的变化特征,以揭示新的变化规律。2010年,Xu等研究发现与正常乳腺细胞相比,在肿瘤细胞的不同细胞器内其蛋白表达种类和水平都发生明显变化。例如从图4-1可知,在正常乳腺细胞中细胞骨架蛋白所占的比例是3%,在肿瘤细胞中其比例上升至12%(图4-2);而线粒体蛋白则由正常细胞中的18%降至肿瘤细胞中的10%。这说明在乳腺癌发生过程中,这两类蛋白的数量和表达水平发生了明显变化,而这些变化与肿瘤的发生有着密切的联系。随着蛋白质组学及其研究技术的不断更新和发展,人们将有可能阐述乳腺癌的发病机制,为其预防和早期治疗提供新的思路和方法。

图4-1 正常乳腺细胞中各类蛋白比例

图4-2 乳腺癌细胞中各类蛋白比例

蛋白质组学与乳腺肿瘤的转移

乳腺癌细胞转移是患者死亡的主要原因之一。尽管有关肿瘤的发生及转移的机制已经在病理学和形态学等多方面做了大量的研究与探讨,但是,肿瘤形成及转移的分子基础和机制尚不清楚。目前研究肿瘤转移分子机制的思路主要是研究比较高、低(或无)转移潜能细胞系,或者是比较原发灶与转移灶的差别,寻找与转移相关的正性或负性的调控因素。运用蛋白质组学的研究手段,比较正常状态下与病理状态下的细胞或组织中其蛋白质在表达数量、表达位置和修饰状态上的差异,可以发现与病理改变有关的蛋白质和疾病特异性蛋白质。针对肿瘤微转移的研究目前一直停留在检测血液、骨髓及淋巴结等标本的肿瘤标记水平上,聚合酶链反应(PCR)是检测微转移最敏感的方法,仅依靠PCR或者是巢式PCR,阳性结果是多样性的,这可能与引物的选择、反应的条件或模板的数量有关。即使在标本中检测出肿瘤细胞的标记,还不能说明肿瘤最后就一定能够转移,因为其中部分肿瘤细胞在后来是被消灭的。定量PCR和反转录PCR(RT-PCR)可能是更加有效的方法,因为定量分析要比发现肿瘤细胞是否存在可能更有意义。因为肿瘤细胞mRNA的表达水平是不一样的,定量RT-PCR也受到很多限制。利用比较蛋白质组学的研究是在功能层面-蛋白质水平的研究,可能为提高目前微转移检测水平提供新的思路。

蛋白质组学与乳腺癌的早期诊断

乳腺癌从遗传角度可以分为散发型和遗传型,后者是指BRCA-1基因或BRCA-2基因发生突变。有人利用组织芯片研究20例BRCA-1突变型、14例BRCA-2突变型以及59例散发型乳腺癌中37种蛋白的表达情况,这些蛋白包括激素受体、P53蛋白、ErbB-2(HER-2)蛋白、细胞周期调节蛋白等。结果显示,与BRCA-1突变型相比,细胞周期蛋白D(D1、D3)以及细胞周期蛋白依赖激酶调节剂在BRCA- 2突变型及散发型乳腺癌中明显上调。

炎性乳腺癌(inflammatory breast cancer, IBC)是一种发病率很低(约3%)但恶性程度极高的乳腺癌类型,从临床表现和病理学上诊断都非常困难。有的研究用组织芯片比较IBC与其他类型乳腺癌蛋白质表达差异,结果表明E-钙黏蛋白(E-cadherin)与RhocGTP酶(RhocGTPase)在IBC中过表达。Char等对80例IBC与552例非炎性乳腺癌蛋白质组学研究,多变量分析表明IBC中E-钙黏蛋白高表达,ER阴性,核增殖基因的表达产物MIB-1阳性,黏蛋白-1(MUC-1)阳性,癌基因HER-2的表达产物阳性。

核基质蛋白(nuclear matrix protein, NMP)在细胞恶变以及肿瘤侵袭、转移过程中扮演重要角色。Luftner等通过蛋白质组学的研究证实,相对分子质量为28 300的NMP-66是乳腺癌早期诊断的一种潜在的血清标记,对乳腺癌的诊断敏感度达100%,排除非恶性肿瘤的特异度达90%,远高于临床上的其他检测手段。Zhang等应用SELDI-TOF-MS和蛋白质芯片方法对38例乳腺癌患者、33例乳腺良性疾病患者以及43名正常妇女的血清蛋白质组学研究发现,在乳腺癌和非乳腺癌患者中出现4个差异蛋白峰,其灵敏度和特异度均为73.7%。

蛋白质组学与乳腺癌的预后评价

有研究对1576例乳腺癌蛋白组学分析表明,14-3-3蛋白高表达则预后不良。同样,有研究显示若上皮细胞黏附分子(epithelial cell adhesion molecule,EpcAM)、早期胎盘胰岛素样生长因子(early placentae insulin-like growth factor, EPIL)在乳腺癌组织中表达则预后差;若FHIT和Bc1-2高表达则预后好。有一项研究在930例乳腺癌组织中检测到13种蛋白,多变量分析表明Bcl- 2为唯一独立的与预后相关的因素。应用SELDI-TOF-MS技术对81例早期乳腺癌患者的血清蛋白质组学研究鉴定出结合珠蛋白、补体片段C3a以及转铁蛋白等5种蛋白质与乳腺癌的预后相关。

蛋白质组学与乳腺癌的分子分类

在以前的研究中,根据乳腺癌表达ER和PR的有无将其分为阳性和阴性两大类。这样分类的好处在于ER和PR均表达阳性者用内分泌治疗效果好,预后也好,这也从一个侧面反映了很多基因表达与ER和PR水平相关。Perou等根据乳腺癌上皮细胞的类型进行分类,因为他们发现某些基因的表达与细胞类型相关,如基底样型或腔面型。另外,这种分类方法还与特异基因改变以及信号转导通路有关,如分出HER-2蛋白阳性一类。这种分类法已经通过对导管上皮细胞和基底细胞角蛋白进行免疫组化染色得到证实。随后再结合ER的情况,将ER阳性乳腺癌分为5个亚型,即腔面A型、腔面B型、基底样型、HER-2过表达型、正常乳腺细胞样型。利用组织芯片技术,将ER阳性和ER阴性乳腺癌又分出两个亚类。在ER阳性的两个亚类中,两者都表达导管细胞CK8、CK18,而在HER-2、Myc和PGR蛋白的表达上存在差异;在ER阴性的两个亚类中,其中只有一个亚类表达基底细胞CK。

蛋白质组学与乳腺癌的信号转导

功能蛋白质组学研究发现,除雌激素以外,生长因子对乳腺癌的发生、发展也起着非常重要的作用。其中的生长因子有FGF和神经生长因子(nerve gowth factor, NGF)。FGF-2对乳腺癌细胞的增殖和迁移起着非常重要的作用。用FGF-2刺激乳腺癌细胞MCF-7 12小时后,发现4种蛋白表达上调,包括HP 90、HP 70、增殖细胞核抗原(PCNA)和转录调控肿瘤蛋白(TCTP)。NGF是最近发现的促进乳腺癌细胞增殖和存活的生长因子,研究表明其通过两种不同的受体发挥作用:一种为酪氨酸激酶A受体(TrkA);另一种为p75NTR。一方面NGF通过与其受体TrkA的结合激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activating protein kinase, MAPK)通路,引起细胞增殖;另一方面NGF通过与受体p75NTR的结合,诱导核移位而使细胞能够存活。有趣的是,许多生长因子受体,如胰岛素样生长因子受体(insulin-like growth factor receptor, IGFR)、FGFR、EGFR、NGFR与乳腺癌的预后相关。显然,生长因子信号在乳腺癌的发生和发展中起着非常关键的作用,这也许对乳腺癌的预防、检测和治疗提供了一种策略。

寻找肿瘤标记

Becker等对17例乳腺癌和1名健康人血清进行了研究,产生了7个生物标记,灵敏度和特异度均为87%;用3个生物标记作分类后,灵敏度和特异度分别为93%和73%。Li等在乳腺癌研究中,利用SELDI-MS蛋白芯片系统得到乳腺癌患者血清与正常对照血清的蛋白质谱,对比分析后找出3个蛋白来诊断0~III期乳腺癌,敏感度与特异度分别为91%和93%。虽然目前不断有乳腺癌相关的标记标被陆续检测出来(表4-2),但被学术界广泛认可的分子标记尚未找到。

表4-2 在乳腺癌中鉴定的一些标记

了解乳腺肿瘤细胞生物学特性

Zhang等采用高效液相-质谱联用技术(LCM)和2-DE研究发现,e-erbB-2基因阳性的标本中CK19的表达阳性率为77%,而c-erbB-2基因阴性的肿瘤中仅为48%。提示在c-erbB-2阳性肿瘤中,CK19与细胞内及细胞间复杂的信号转导有关,导致肿瘤强侵袭性和易于转移。使用SELDI-TOF-MS技术对30例无淋巴结转移的乳腺癌患者与30例有淋巴结转移的乳腺癌患者癌细胞质进行蛋白质对比,表达谱中共发现73个峰值,其中2个峰值指标代表的蛋白质可能具有提示乳腺癌转移预后判断的能力。进一步研究证实,泛素化和铁蛋白轻链是对应研究中发现的那2个峰值蛋白质,表明泛素化和(或)铁蛋白轻链的表达提示乳腺癌患者预后较好。

乳腺癌治疗靶标的寻找

用化疗的方法消除乳腺癌细胞可能会导致耐药现象,通过对功能蛋白质组学的进一步研究,可以增加对耐药现象的认识并指导乳腺癌的个体化靶向治疗。通过对人乳腺癌细胞系MCF-7的线粒体蛋白质进行二维电泳,发现在184个蛋白质印迹点所代表的156种蛋白质中,有11种线粒体蛋白质丰度发生改变,表明对多柔比星耐药的细胞株同时对维拉帕米产生耐药,且证实上述改变是细胞产生耐药性的原因。对81例术后乳腺癌患者的血清进行SELDI-TOF-MS研究,发现触珠蛋白、补体片段C3a、转铁蛋白、载脂蛋白cI和Al的改变可能为乳腺癌综合治疗后疗效的血清学判别指标。研究发现,HER-2阳性乳腺癌是一种特殊类型,使用曲妥珠单抗与标准化疗药物联用可以阻断HER-2信号转导,能显著提高这类早期乳腺癌患者的生存率。