发光免疫分析激素测定的类型(内分泌学 激素测定)

发光免疫分析技术是指将发光分析与抗原抗体免疫反应相结合而建立起来的一种新型超微量分析技术，它包含免疫反应系统和化学发光分析系统两个部分。该技术既具有发光分析的高灵敏性，又具有抗原抗体免疫反应的高特异性。目前，各种自动化发光免疫分析技术已成为临床医学和生物学研究领域得到广泛应用的一种新的检测手段和诊断技术（如绵羊组织化学染色等）。

根据发光免疫分析技术的发光反应体系和标记物及标记方法的不同，可将发光免疫分析技术分为化学发光免疫分析（CLIA）、化学发光酶免疫分析（CLEIA）、电化学发光免疫分析（electrochemiluminescence immunoassay，ECLIA）和生物发光免疫分析（bioluminescence immunoassay，BLIA）4类。

化学发光免疫分析基于竞争性抑制反应或非竞争性全量反应原理

CLIA的检测原理类似于RIA或IRMA和EIA，只是所用的标记物或检测的信号不同而已。它以化学发光物质（如鲁米诺和吖啶酯等）标记抗原或抗体，免疫反应后直接引发化学发光，根据检测到的发光强度进行定量。其反应原理也有竞争性抑制和非竞争性全量反应两种形式。

竞争性抑制反应式

在化学发光免疫分析中，竞争性抑制反应的反应式可用下式表示，即：

非竞争性全量反应式

非竞争性全量反应式可表示如下，即：

两反应式中的Ag·L为抗原标记的发光物质或底物；SP·Ab为固相抗体；Ab·L为抗体标记的发光物质或底物。

化学发光酶免疫分析使检测灵敏度显著提高

本法用参与某一发光反应的酶来标记抗原或抗体。在反应体系中待免疫反应完成后，加入发光试剂，测定发光体系的发光强度，对待测抗原或抗体进行定量分析。以血清T₃的定量测定为例，其原理是采用双（2，4，6-三氯苯基）草酸酯（TCPO）发光体系和葡萄糖氧化酶（GOD）标记（抗原）T₃，反应式如下：

抗原抗体反应采用竞争抑制法，通过测定反应体系中的发光强度可求得样品中T₃的含量。目前该方法操作繁杂、费时（4℃过夜），临床普及应用受到限制。但该技术所具有的优点是将亲和素-生物素与增强化学发光酶免疫分析联用，可使检测灵敏度达到10^-18～10^-21 mol/L。

电化学发光免疫分析是电化学发光和免疫测定技术相结合的产物

ECLIA与一般化学发光不同，它是在电极表面由化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光2个过程，是电化学发光和免疫测定技术相结合的产物。ECLIA虽问世时间较短，但根据其原理设计的自动化分析仪器已在激素和DNA扩增产物及各种免疫学检测中得到了迅速推广应用。

ECLIA的基本原理

ECLIA采用发光试剂三氯联吡啶钌［］ 作为标记物，其结构见下图。在三丙胺阳离子自由基的催化作用和三角形脉冲电压的激发下，可产生高效稳定的连续发光，两者在电化学发光反应中的作用机制见下图，其电化学发光基于Ru（bpy）₃ ²⁺络合物和三丙胺两种电化学活性底物在反应中引起的光子发射。在此反应过程中，当电极被施加电压时，二价的三氯联吡啶钌［］发生氧化反应释放电子，而成为三价的三氯联吡啶钌［］；同时，反应体系中的也在电极表面发生氧化反应而成为阳离子自由基极不稳定，在水相中易失去一个质子（H⁺）而形成自由基。由于是强氧化剂，而是强还原剂，两者迅速发生氧化还原反应，使还原成激发态，其能量来源于与之间的电势差，激发态以荧光机制衰变，并同时释放出波长为620nm的光子。成为基态的再参与发生在电极表面的化学发光反应，使这一氧化还原反应循环进行，测定信号不断放大，从而大大提高了检测的灵敏度。

联吡啶钌结构示意图

联吡啶钌电极表面的发光反应示意图

注：：联吡啶钌还原态；：联吡啶钌氧化态；Ru：联吡啶钌激发态；TPA：三丙胺

ECLIA的检测程序

该法在分析临床样品时，先将样品（血清等）与试剂加到反应管中，在流动测量池外进行孵育，待包被好的磁性微球、样品及标记抗体充分反应后，再由分析仪的蠕动泵将其吸入流动测量池进行检测。在流动测量池中，被磁性微球捕获的在位于激发电极下面磁铁的作用下被吸附、浓聚于电极表面3nm的激发区域内，由施加的电压激发和发生电化学发光反应，并发射出光子供检测。检测结束后，蠕动泵吸入清洗液对流动测量池进行清洗，清洗完成后再吸入另一份预备好的标本进行测定，每份样品的测试和清洗流动测量池的周期仅需25秒。

由于ECLIA的分离系统采用磁性微球包被链霉亲和素-生物素捕获法，利用了两者的高度亲和力（K_A=10¹⁵）、免疫放大能力和反应系统中的磁分离功能，使抗原、抗体反应在磁性微球表面快速进行，从而大大缩短了反应时间（＜20分钟）。同时利用电极外磁铁的磁力作用将结合相与游离相分开，使检测操作步骤大大简化，更易于自动化分析。

ECLIA的优点

ECLIA和普通化学发光技术相比，其具有明显的优势，主要区别在于标记物的不同，一般化学发光（酶促发光）是标记催化酶（辣根过氧化物酶、微过氧化物酶等）或化学发光分子（鲁米诺、吖啶酯等），这样的发光反应一般发光不稳定，为间断的闪烁性发光，且在反应过程中易发生裂变，导致反应结果不稳定；此外，检测时需对结合相、游离相进行分离，操作步骤多，测试成本高。而ECLIA不同，它是一种电促发光，其发光反应的物质基础为络合物和TPA⁺等2种电化学活性底物，可产生高效、稳定的连续发光；同时，由于在发光反应中的循环利用使发光得以增强、稳定，每秒几十万次的循环电化学发光大大提高了分析的灵敏度。而且检测采用均相免疫测定技术，不需将游离相与结合相分开，从而检测步骤大大简化。此外，它采用特殊的化学发光剂作为标记物，既避免了（¹²⁵I或¹³¹I）放射性核素的半衰期短和放射性危害，又克服了酶标记的不稳定性和荧光标记法的本底荧光干扰的缺点，而钌标记物稳定，在室温下半衰期大于1年，经化学修饰后形成的有活性的NHS酯或磷酰胺基团很容易与蛋白质、激素、核酸及半抗原等分子结合，从而具有更广泛的分析适用性，所形成的钌［］结合物其活性在2～5℃可保持1年以上。的分子量较小，在一个抗体等分子上可同时标记上多个（＞20个）　，而不影响抗体的活性，钌也可以用于标记核酸和PCR引物，而不影响探针的杂交活性和引物的特异性。标记物在反应体系中循环利用，使发光时间延长和强度增加。将链霉亲和素系统与磁性微球技术结合，使检测灵敏度（＜10^-12mol/L）大大提高，线性范围更广（10⁴），反应时间缩短（＜20分钟），最快可在2小时内发出检测报告，是其他免疫分析技术无法比拟的。由于ECLIA的原理新颖，反应不同于酶联反应受操作等多种干扰因素的影响，使测量结果具有更好的重复性。

生物发光免疫分析是抗原抗体反应与生物发光反应系统相结合的分析技术

随着人们对生物发光现象的深入研究，进一步加深了对各种生物发光反应原理的认识，揭示发生在生物体内的各种发光现象都与化学反应有关，即生物发光就是发生在生物体内的一种化学发光。BLIA是抗原抗体反应与生物发光反应系统相结合的一种分析技术，它利用生物发光物质或参与生物发光反应的辅助因子如辅酶Ⅰ（NAD）、三磷腺苷（ATP）等标记抗原或抗体，在实验过程中，先将标记抗原（或抗体）与待测抗体（或抗原）发生免疫反应后，再运用生物发光反应系统进行检测。