ErbB-2信号通路及HER-2人源化单抗的作用机制(乳腺肿瘤学 HER-2的检测及其临床意义)
HER-2的分子特征
人表皮生长因子受体-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）也被命名为neu、ErbB-2、CD340或者p185，是erbB-2基因编码的细胞膜糖蛋白，属于表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor, EGFR/ErbB）基因家族成员，其相对分子质量185 000。与HER基因家族的其他成员一样，HER-2分子包含了一个N末端的胞外结构域（extracellular domain, ECD）、一个跨膜结构域、一个酪氨酸激酶活性结构域（TK domain）和一个相对不太保守的C末端尾（图20-1）。其中N末端的胞外结构域由大约600个氨基酸残基组成，包含结构域I～IV，同时在结构域I～III也是结合胞外信号的位点。胞外结构域可以在近膜端发生蛋白剪切作用，形成相对分子质量为95 000的高活性HER-2分子p95。由于p95的胞外结构域已经被剪切，而胞外结构域恰好是曲妥珠单抗（trastuzumab）的识别位点，因此p95对曲妥珠单抗是没有反应的。同样，在免疫组化的检测中若使用的一抗是识别胞外结构域的，那么p95是不能被免疫组化检测出来的。
图20-1 HER-2分子结构特点
HER\\ErbB家族信号通路的激活
细胞的生长、增殖、凋亡、分化等状态通常受到细胞周围环境和整个机体的影响。细胞通过细胞膜上的受体接受胞外的信号分子（如配体信号）而启动下游基因的表达。受体-配体的相互作用是特异性的，并且可以结合细胞内相关的特异信号转导分子有序地传递信号，通过调控某些转录调控因子（transcriptional factor，TF）与细胞核内的DNA结合并启动（抑制）相应基因的转录，最终产生特定的效应（如细胞分裂、分化、凋亡等）。其中，细胞膜蛋白酪氨酸激酶受体（tyrosine kinase receptor）是接受胞外信号并将其转导到胞内的主要参与者。因此，酪氨酸激酶受体基因的异常通常可引起严重的后果，如恶性肿瘤的发生。
在HER/ErbB家族信号通路中，HER-1（ErbB-1, EGFR）、HER-2（ErbB-2, neu）、HER-3（ErbB-3）、HER-4（ErbB-4）是存在于细胞膜的酪氨酸激酶受体。一系列与EGF相关的多肽配体都可与ErbB受体家族蛋白胞外部分相结合。目前报道与HER-1相结合的配体有EGF、转化生长因子α（transforming growth factor α, TGF α）、双调蛋白（amphiregulin）、乙胞素（betacellulin, BTC）、肝素结合EGF（HB-EGF）和外调蛋白（epiregulin，EPG）；与HER-3相结合的配体有神经调节蛋白-1（neuregulin-1,NRG-1）、NRG-2；与HER-4相结合的配体有NRG-1、NRG-2、NRG-3、NRG-4、BTC、HB-EGF和EPG。非常有趣的是，目前还没有发现与HER-2相结合的任何配体（图20-2）。当HER受体与胞外的信号分子结合后会自我配对（homodimerization）或者相互配对（homodimerization）形成复合物，进而激活整个信号通路。
图20-2 HER/ErbB家族信号通路
没有配体的HER-2受体是怎么启动HER-2介导的信号通路呢？目前通过结构生物学的研究发现，在ErbB-1、ErbB-3和ErbB-4配体不存在的情况下，这3个酪氨酸激酶受体处于“束缚状态”。在这个状态下，蛋白结构域II与蛋白结构域IV相互发生物理结合（图20-3）。“束缚状态”的酪氨酸激酶受体ErbB-1、ErbB-3和ErbB-4的结构域I和III可以结合胞外的配体，导致ErbB-1、ErbB-3和ErbB-4将从“束缚状态”变成“伸展状态”并暴露其二聚体结合臂。对于没有配体的HER-2而言，不管有没有胞外配体存在，会一直处于“伸展状态”。任何其他ErbB家族的受体在配体的刺激下立即可以与HER-2形成异二聚体（hetero-dimer），因此HER-2在HER/ErbB家族信号通路中处于核心位置。HER-2另外一个显著的特征是，当HER-2基因过表达时，可以激活HER-2介导的信号通路并激活下游的胞内信号，该过程与细胞所处的环境中有无配体及数量无关。目前认为，两个HER-2分子之间自身形成的同二聚体并非胞外的结构域相互作用，其相互作用的位点应该在垮膜区域或者在胞内。
图20-3 HER/ErbB家族蛋白与配体的结合
HER受体家族在细胞膜形成二聚体后，将启动下游比较复杂的信号转导分子事件，特别是在其他信号通路共同参与下形成信号通路的“分子交谈”（cross-talk），使HER/ErbB家族信号通路变得尤其复杂。例如G蛋白偶合受体、细胞因子受体和类固醇激素受体都有可能与HER/ErbB家族信号通路形成分子交谈。但是，当HER受体激活后主要的还是PI3K/Akt和Ras/Raf/MEK/MAPK两条信号转导途径被激活。当细胞膜表面二聚体形成后，酪氨酸将被磷酸化，在HER受体胞内部分被磷酸化的位点将形成“停靠站点”（docking site），以吸引胞内特定转接蛋白（adaptor protein）。这些转接蛋白包括Grb2、Shc、Src、PI3K（p85）等，当它们与HER家族蛋白的胞内段结合后将会启动多个下游信号通路。不同的胞内转接蛋白与HER家族成员的胞内“停靠站点”结合后将启动不同的信号转导通路。例如Shc、Grb2可以与所有HER家族成员结合活化RAS蛋白，启动丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路。PI3K与HER家族蛋白的胞内“停靠站点”结合后将启动PI3K/Akt信号通路。这些信号转导通路的激活将会将信号传入细胞核启动相应的基因转录，导致细胞增殖、迁移、浸润、抗凋亡和促进血管生成等反应（图20-2）。因此，发展抗HER的人源化单抗（如曲妥珠单抗）最初的设想就是阻断erbB-2基因扩增导致HER在癌细胞表面过表达及ErbB-2信号通路的异常激活。
曲妥珠单抗的发展
在20世纪80～90年代超过100种抗HER-2单抗被发展用作临床验证。其中，Genentech公司的4D5单抗在体外实验中显示出了很好的抗肿瘤特性，随后研究人员对小鼠来源的4D5单抗进行了人源化改造，形成了一系列的人源化单抗。有些人源化的4D5单抗在体外实验中虽然具有对HER-2高度的亲和力，但是其失去了抗细胞增殖的能力。还有一些在人源化后保留了抗细胞增殖的能力，其中的一个克隆被挑选出作为临床研究对象，并被命名为曲妥珠单抗。人源化过程中，筛选抗体最重要的指标是其抗体依赖性细胞毒性（antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC）或者补体依赖性细胞毒性（complement dependent cytotoxicity, CDC）的活性。曲妥珠单抗相对于其小鼠来源的4D5原型，在体外的细胞培养中虽然表现出略弱的抗细胞增殖活性，但是在小鼠成瘤实验中却表现出与之相当的抗肿瘤活性。
曲妥珠单抗的作用机制
目前，虽然曲妥珠单抗对HER-2扩增的乳腺癌患者的治疗有显著效果，但其机制并不清楚。在过去的10多年里，研究人员为曲妥珠单抗作用机制的研究做了大量工作，提出的主要作用机制可以归为以下几种模型。
目前，最简单的猜想模型是抗HER-2单抗4D5通过与细胞膜表面的识别位点结合，导致细胞膜表面相应受体的降解。虽然这个猜想模型看似简单，但大量科学研究显示相互矛盾的结论，不能统一支持这样的假说。某些研究显示在HER-2扩增的患者中，曲妥珠单抗可以负调控HER-2的表达；而另一些报道显示在这类患者中曲妥珠单抗并不能负调控HER-2的表达。但是，目前这个问题得到了部分的解答。Austin等的研究显示，当曲妥珠单抗进入体内后，初始阶段与HER共同出现在细胞膜表面，进而被动地伴随HER-2进入正常的细胞内吞途径。这个研究结果显示，曲妥珠单抗对HER-2过表达乳腺癌患者的治疗作用可能并不是通过负调控HER-2的表达来完成的。
第二个模型是干预HER-2的信号通路。在20世纪90年代，对于曲妥珠单抗和其他多个抗HER-2单抗设计的主要思路是竞争性结合HER-2受体，阻断HER-2信号通路的开启。但是，从目前的研究情况看来，HER-2的配体还没有被发现，其受体的激活取决于同一基因家族中其他HER受体接受配体后与HER-2形成二聚体。事实上，HER-2的胞外结构域持续处于活性状态，类似于相同基因家族中其他家族成员已经结合了配体的状态，因此排除了其再结合任何配体的可能。由此推翻曲妥珠单抗是通过直接与HER-2受体的配体竞争结合位点，从而达到抑制HER-2介导的信号通路的假说。对于曲妥珠单抗通过竞争结合受体上的结合位点的假说还有另外一种解释，即虽然曲妥珠单抗不能竞争性地结合HER-2受体上的配体结合位点，但是其可以与HER家族的其他成员如HER-1、HER-3和HER-4的胞外受体结合并阻断与相应配体的结合，从而阻断其激活信号通路的能力。但是，目前还没有令人信服的实验证据支持这样的假说。例如在免疫共沉淀实验中，曲妥珠单抗并不能减少HER-2与HER-3形成异二聚体的量，荧光共振能量转移（fluoresence resonance energy transfer，FRET）的实验结果也显示曲妥珠单抗并不能抑制HER-2与HER-1（EGFR）或者HER-3的结合。
第三个模型是HER-2分子的剪切。正如前面所介绍的HER-2的分子特征，正常情况下其相对分子质量为185 000。某些特殊患者的HER-2蛋白分子是经过剪切的，相对分子质量为95 000，这种形式的HER-2也被称作p95。有学者提出，曲妥珠单抗可以通过与HER-2受体结合后阻止HER-2从相对分子质量185 000的完整状态剪切为p95。由于p95的活性更强，并且与癌浸润、酪氨酸激酶活性和远端转移都有密切的关系，因此曲妥珠单抗达到了抑制HER-2活性的效果。但是，这样的假说也遭到了其他学者的质疑。例如HER-2功能的发挥是否一定需要其相对分子质量由185 000的形式剪切为p95的形式还尚存争议，而且很多HER-2基因扩增的患者并没有p95存在。
第四个是疫分子模型。人源化的曲妥珠单抗及其小鼠单抗原型（mAb）4D5在体内实验中的抗癌作用机制目前至少部分可以解释为免疫识别机制。mAb 4D5可以在体外实验中通过抗原-抗体特异识别目标细胞并激活抗体依赖性细胞毒性。mAb 4D5人源化后形成曲妥珠单抗，其抗体依赖性细胞毒性得到进一步加强。另外，在小鼠动物模型中，通过人为控制Fc受体状态，可以证明宿主在受到这类单抗药物处理后其免疫系统确实参与抗肿瘤机制。实验研究表明，Fcγ受体基因缺失小鼠在接受mAb 4D5和曲妥珠单抗处理后，其抗肿瘤能力几乎全部消失。相反，对于小剂量mAb 4D5和曲妥珠单抗处理的小鼠，若人为增强Fc受体，其抗肿瘤能力将大大增强。同样，若mAb 4D5单抗在与Fcγ受体结合的Fc片段位点出现基因突变，虽然其抗增殖能力仍然保留，但是其抗体依赖性细胞毒性和抗肿瘤能力将消失。这样的动物模型说明曲妥珠单抗在体内的免疫识别机制能够很好地解释其抗肿瘤的能力。
曲妥珠单抗的耐受机制
目前，临床HER-2过表达的乳腺癌患者在使用抗HER-2的治疗中往往出现一些耐药现象。对于曲妥珠单抗的耐药机制，目前主要认为是一类异常的HER-2分子即p95在起作用。相对于p185的HER-2，p95可以持续表现出更加激活的状态。而且由于其胞外曲妥珠单抗的结合部位不存在，因此并不能被胞外单抗识别而躲过曲妥珠单抗的作用。
另外，目前发现在HER-2下游的信号转导分子常常会发生基因突变，导致拮抗HER-2治疗的失败。在正常情况下，HER-2下游信号转导分子的激活是由HER-2的活化状态调节的，而HER-2的活化状态又取决于胞外信号配体以及HER-2基因过表达等多方面因素。当这些下游信号转导因子发生突变，HER/EerB家族信号通路的激活和关闭将不再受制于HER-2的状态，从而表现出持续的激活状态，不断地启动细胞分裂增殖，整个过程与HER-2或者抑制HER-2的情况呈不相干的独立关系。在乳腺癌患者中，Ras和BRAF突变相对较少，而在HER-2过表达的患者中PIK3突变发生较多，并且某些时候可以伴有少量病例的PTEN突变。但是，目前并没有证据显示在HER-2过表达的乳腺癌患者中PIK3突变与酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitor, TKI）的耐药有关。值得注意的是，实验中通常使用的BT474细胞株，其特征是HER-2基因扩增，其对于TKI和曲妥珠单抗的干预都十分敏感。但是，该细胞株被发现在PIK3的外显子1内有一个不常见的基因突变。在乳腺癌患者中，PTEN突变是比较少见的，其蛋白水平的低表达可能具有比较重要的意义。在HER-1扩增的乳腺癌患者中，PTEN蛋白的低表达可以导致患者对TKI治疗的失效。但是，在HER-2扩增的患者中并没有看到类似的结果。从理论上讲，这些临床的耐药分析有一个前提，就是这些药物能够有效抑制HER-2的功能。但是，HER-2的曲妥珠单抗对乳腺癌患者的作用机制并不清楚，而且有证据显示其并非简单的抑制作用，TKI的研究也表明其在胞内对于癌基因HER-2只有部分抑制作用。