发光标记物与标记方法(内分泌学 激素测定)

发光免疫分析中所使用的标记物主要分为直接参与发光反应的标记物、不参与发光反应的标记物和酶标记物三类，此种分类方法对标记物的选择、检测方案和测定条件的设计，以及分析结果的评价等都具有重要意义。

参与发光反应的标记物分为鲁米诺/异鲁米诺类和吖啶酯类及联吡啶钌三类

在发光免疫分析过程中，这类标记物直接参与发光反应，它们在化学结构上有产生发光的特有基团，一般没有本底发光，可以检测到极低水平的标记物，且制备标记物的耦联方法对发光效率的影响不大，因此，这类标记物类似于放射性核素标记物，有以下3类。

1. 鲁米诺和异鲁米诺类：鲁米诺是最早合成的发光物质，也是一种发光标记物，但其耦联于配体形成结合物后，其发光效率下降。而异鲁米诺及其衍生物，如氨丁基乙基异鲁米诺和氨己基乙基异鲁米诺等克服了这一缺点。

2. 吖啶酯类：吖啶酯类是一类发光效率很高的化学发光剂，可用于半抗原和蛋白质的标记，标记抗体时可获得较高的比活性，常用于多抗或单抗的标记，对建立双位点免疫化学发光分析具有优势。

3. 联吡啶钌标记物： 联吡啶钌是目前仅用做电化学发光免疫分析的标记分子（强氧化剂），在脉冲电压激发下由三丙胺阳离子自由基催化而产生高效稳定的连续发光，检测采用均相免疫测定技术，不需将结合相与游离相分开，易于分析自动化。的分子量较小，经化学修饰后形成的具有活性的NHS酯或磷酰胺基团，在一个蛋白质、激素、核酸或半抗原等的分子上，可同时标记上20个以上的分子而不影响被标记物的活性，且具有广泛的分析适用性。标记寡核苷酸引物时，能在DNA合成仪合成引物的同时自动进行标记，无须分离提纯，标记有效率＞90%，不影响杂交稳定性，耐热，不受电化学中其他化学反应的干扰和内源性金属离子的干扰，与被标记物所形成的盐是很稳定的水溶性化合物，在2～5℃可保存1年以上。

不参与发光反应的标记物作为发光反应催化剂或能量传递体

标记物不直接参与化学发光反应，也不影响发光体系中总的光输出，而是加入起发光反应的发光物质越多，体系中产生的发光强度就越大。

1. 过氧化物酶：这类标记酶主要是辣根过氧化物酶（HRP），它在碱性环境中对鲁米诺和过氧化氢（H₂O₂）的反应起催化作用，但在较高pH条件下进行时，酶的活性较低，主要是酶结构中的铁卟啉部分起催化作用，蛋白质部分仅提供与其他分子共价结合的功能团。
2. 荧光素酶：它是荧光素与三磷腺苷（ATP）的催化酶，也可作为标记酶用于甲氨蝶呤和肿瘤坏死因子（TNF）的测定，对TNF的最小检测限可达10fmol/L。
3. 荧光素：在TCPO发光反应体系中，荧光素作为一种能量传递的接受体，在反应时不被消耗，这类发光反应体系所发出的光与荧光物质的浓度成正比，故可作为标记物用于化学发光免疫测定。

利用某些标记酶催化生成的产物，再作用于发光物质，以产生化学发光或生物发光。分析物的检测灵敏度依赖于产物的生成量。常用的标记酶有4种：

1. 葡萄糖氧化酶（GOD）：GOD能将葡萄糖氧化成葡萄糖酸并形成H₂O₂，H₂O₂可由加入的鲁米诺和适当的催化剂进行检测。用GOD作标记物的发光反应体系，其检测灵敏度达10^-17mol/L，如对17α-羟孕酮的测定灵敏度达0.5pg/管，对T₄的最低检测限为6.4fmol/ L。
2. 碱性磷酸酶（ALP，AKP）：用ALP作标记物，以ATP为底物，运用荧光素酶-ATP发光反应体系进行检测，可以建立很多种高度灵敏的发光免疫分析方法。
3. 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PDH）：该酶能催化NAD形成NADH，然后利用生物发光反应体系检测NADH。以G-6-PDH作标记物，运用生物发光体系检测TNF的灵敏度可达10^-17mol/L。以G-6-PDH标记孕酮，用生物发光免疫分析技术进行快速检测时仅需25μl样品。
4. 丙酮酸激酶：用该酶作标记物在催化反应中形成ATP，再用荧光素酶-ATP发光系统进行检测，目前已建立了很多种发光免疫分析方法。

化学标记法和生物标记法各有优缺点

前者是利用某些植物、动物或微生物在生理代谢过程中吸收某些简单的发光物质，从而制得发光标记物；后者是通过化学反应将标记物和被标记物耦联，使被标记物保持自身的免疫学性质和标记物仍具有化学发光性质。在发光免疫分析中，常用标记物大约为两类，一类是直接用发光物质（如鲁米诺和异鲁米诺及吖啶酯类等）标记抗原或抗体；另一类是用发光反应的催化剂（如GOD、HRP或TPA等）或协同因子（如ATP、NAD等）标记抗原或抗体。按照被标记物分子结构的大小和性质，可分为小分子（如甾体类激素或药物等）的标记和生物大分子（如抗体、核酸及某些配体、载体等）的标记；又根据标记反应的类型以及形成结合物的结构特点，标记反应被分为直接耦联和间接耦联两种方式。

直接耦联是指通过化学反应将标记物分子的反应基团直接连接到被标记物分子的反应基团上，如碳化二亚胺缩合法、过碘酸盐氧化法、重氮盐耦联法和混合酸酐法等都属于直接耦联方式；间接耦联是指在标记物和被标记物分子之间引入一个连接物或一个基团，使两种物质耦联成结合物。也可通过连接物引进新的活性基团，增加反应活性，或减弱参与耦联双分子结构中存在的空间位阻效应。间接耦联方式的应用范围较广，如琥珀酰亚胺活化法、O-（羧甲基）羟胺法、异硫氰酸酯衍生法和戊二醛法等。标记小分子物质（激素或药物）常用耦联反应或化学反应方法，使标记物和被标记物形成结合物。

交联剂与标记生物大分子形成不可逆连接

1. 碳化二亚胺（EDC）缩合法：

水溶性EDC常用于制备大分子-大分子或大分子-半抗原衍生物的交联结合物。经EDC缩合反应后，蛋白质分子上的游离羧基与发光物质分子上的氨基形成稳定的酰胺键。该法反应温和，适用范围广，被耦联的两物质分子结构中含有羧基或氨基的均可选用此法标记。常用的缩合剂还有1-乙基-3-（3-二甲氨基苯基）EDC和二环己基碳二亚胺等。

2. 重氮盐耦联法：

标记物分子上所含的芳香胺能与NaNO₂和HCl反应生成重氮盐，该重氮盐能直接与蛋白质分子的酪氨酸残基上酚羟基邻位、组氨酸残基的咪唑环以及色氨酸残基的吲哚环反应，形成偶氮化合物。该法的优点是简易、成本低廉和重复性好。但分子结构中不含芳香伯氨基的标记物，则不能选用此法，因为所得的标记产物不稳定。

3. 过碘酸盐氧化法：

该方法先利用过碘酸盐氧化糖蛋白（GP）中糖基的邻二羟基成为醛基，再通过醛基与发光剂的伯氨基反应形成Schiff碱，后者经NaBH₄还原—N‖C—键成为稳定的结合物。此单链连接的发光剂标记GP的稳定性好，标记物不易脱落。凡含有芳香伯胺和脂肪伯胺的发光剂均可采用此法标记。

4. 混合酸酐法：

标记物或被标记物分子中含有的羧基，在三乙胺或三正丁胺等存在时，先与氯甲酸酯反应生成活泼的混合酸酐中间体，再与另一分子的氨基反应形成酰胺键连接的化学发光标记物。

5. N-羟基琥珀酰亚胺活化法：

被标记物（蛋白质）分子中的羧基，经N-羟基琥珀酰亚胺活化后，再与发光剂的氨基耦联形成以酰胺键相结合的发光标记物。

6. 环内酸酐法：

此法是通过连接物将标记物与被标记物耦联到一起的标记方法，因常用琥珀酸酐作为两者的连接“桥”，故又称琥珀酸酐法。它利用环内酸酐与标记物或被标记物分子的羟基或氨基反应形成半酯或半酰胺，再经EDC缩合法或混合酸酐法使其与另一分子的氨基作用形成酰胺键，然后标记物与被标记物通过琥珀基连接到一起。该法的优点是可避免使用其他双功能交联剂时存在的不良反应，使标记物与蛋白质分子之间形成单向定量缩合，具有较高的标记率等。

7. 戊二醛法：

戊二醛是一种双功能交联剂，它所含的两个醛基可分别与标记物和被标记物的伯氨基形成Schiff碱，再由一个五碳桥耦联形成发光标记物，其标记反应式如下：

式中NH₂-L为含有氨基的发光物质，R-NH₂为含有氨基的被标记物。由于戊二醛在溶液中不仅以单体形式存在，而且可以大量的聚合物形式存在，在形成的标记物中被标记物与标记物的分子之间存在较大距离，有利于减少抗原抗体免疫反应时的空间位阻。该法在标记酶的应用中有较深入的研究，但因戊二醛的耦联反应不易定量和欠特异，故在发光免疫分析中尚未得到广泛应用。

8. 异硫氰酸酯法：

该法利用二氯硫化碳先与标记物或被标记物的氨基反应，形成异硫氰酸酯衍生物，再通过结构上的键与被标记物或标记物耦联成结合物，两者的耦联位置主要在赖氨酸残基的游离氨基上，这一标记方法反应温和，获得的结合物稳定，标记后的蛋白质活性不受影响。

9. O-（羧甲基）羟胺法：

被标记物分子结构中（或引进）的羰基可与O-（羧甲基） -羟胺反应，形成O-羧甲基衍生物，该衍生物结构中的羧基再与标记物中的氨基结合成结合物。

合理选择标记物和标记方法是标记成败的关键

若标记物或标记方法选择不当，会造成分析方法的发光效率低下和标记结合物不易保存，或导致标记失败。在电化学发光免疫分析法中，标记物均采用钌［］，它经化学修饰后形成的N-羟基琥珀酰胺酯或磷酰胺化合物，能与蛋白质分子上赖氨酸的ε-氨基或核酸上的氨基形成稳定的酰胺键，其标记结合物不但发光效率高，且在-10℃～-30℃条件下可稳定18个月；对吖啶酯类发光剂也常选用N-羟基琥珀酰胺法进行标记。被标记物为抗原时，抗原应具有较高的纯度和免疫学稳定性，为抗体时应具有较高的效价和减少血清中氧化酶类的影响。依照标记物（发光剂）与被标记物所含反应基团不同，标记反应的一般匹配方式和标记方法的选择原则见下表，其反应基团可以是反应物分子结构中固有的，或是经衍生和耦联形成的，均可参考表中的配置方式和标记方法。

反应基团的匹配和标记方法选择

注：反应基团A和B可分别为标记物或被标记物所含有的基团