火焰光谱法和发光光谱法(内分泌学 激素测定)
火焰光谱法测定K/Na/Ca/Mg/Li/Sr
火焰光谱法（inflame spectroscopy）又称火焰分光光度法，是用火焰作为激发光源的一种发射光谱法。其基本原理是用高温火焰将样品中待测元素的原子激发成激发态，当它们从激发态返回到基态时，以发射光谱的形式释放出所吸收的能量，火焰分光光度计的结构和工作原理见下图。由于不同元素的原子或分子具有不同的能量状态，因此它们发射的光谱线波长也具有各自的特征。如钾发射的光谱波长为766.5nm，钙为422.7nm等。该法常用空气-丙烷（煤气）或空气-乙炔作燃烧气，其火焰温度分别约为1840℃和2300℃，能量较低，可激发的元素仅限于碱金属和碱土金属。待测元素发射谱线的强度（I）与该元素浓度（C）之间的关系可用公式I=a·Cb表示，式中a是同试样的组成与蒸发、激发过程有关的一个参数，在同等条件下与参考品比较，a又是一个常数；b为自吸收系数，在低浓度时，元素的自吸收可忽略不计，即b=1。则公式I=a·Cb可改写成I=a·C。这样，待测元素发射谱线的强度与该元素的浓度即成简单的正比关系。
火焰分光光度计结构示意图
火焰光谱法常用于测定K、Na、Ca、Mg、Li、Sr等元素。由于各元素发射的光谱相互存在不同程度的干扰，其测定的灵敏度受到限制（一般为10-4～10-6 mol/L）。
发光光谱法的灵敏度高且分析快速简便
发光光谱法（luminescent spectrum，LS）又称发光分析法，是利用发光现象研究而建立的一种分析技术。化学发光（chemoluminescence）是指物质伴随化学反应过程所产生的光的发射现象，而生物发光（bioluminescence）是指在生物体内由蛋白质或酶参加反应引起的发光，如萤火虫、水母和某些细菌的发光现象。LS以其灵敏度高、分析快速和简便，而在生物学和医学研究领域得到广泛应用。发光分析法主要包括化学发光分析法和生物发光分析法两种。
化学发光法（CLA）
某些物质在发生化学反应时，吸收了反应过程中所产生的化学能，使反应产物的分子激发到电子激发态，当分子从电子激发态的最低振动能级返回到基态的各个振动能级时，多余的能量以光子（光谱）的形式发射出来，其发射的光谱强度与参加反应的物质浓度在一定条件下成正比，与参比物比较后，可求得待测物的浓度。化学发光有直接化学发光和间接化学发光或敏化化学发光之分。在化学反应中能释放足够的自由能而把一种反应物的分子激发到激发态，若被激发的是反应产物，则称直接化学发光，可用A+B→C*→h·υ+C表示。式中A、B分别为参加反应的A物质和B物质；C*为处于激发态的反应物；C为发射光子（h·υ）后返回基态的反应物。当反应释放的能量传递到另一个未参加反应的D物质分子时，使其激发到电子激发态，并产生发光现象，则称间接化学发光，反应过程式为：A+B+D→C+D*→C+h·υ+D。
CLA与荧光光谱法（SFM）的区别是物质的分子在形成激发态过程中所受的激发能不同，后者是吸收了光能而发射的光谱，而前者是吸收了化学能而发射的光谱。因此，化学发光的前提是反应必须提供足够的激发能，通常只有那些焓变（∆H）介于170～300kJ/mol之间的快速放能（如大多数氧化-还原）反应，才能在可见光谱范围内观察到化学发光现象。
化学发光技术常用于激素、葡萄糖、胆固醇、L-氨基酸及其氧化酶、次黄嘌呤和黄嘌呤氧化酶等的测定以及细胞的代谢与功能研究。常用的化学发光剂有鲁米诺（luminol）、洛粉碱（lophine）、光泽精（lucigenin）和草酸盐类等。
生物发光法（BLA）
生物发光是发生于生物体内的一种化学发光，其基本原理与化学发光类似。生物发光法有荧光素-荧光素酶发光系统和细菌发光系统，在前者，当反应体系中同时存在荧光素（LH2）、荧光素酶（E）、ATP和Mg2+时，先形成E-LH2-AMP（单磷酸腺苷）复合物，然后在氧的参与下，被氧化脱羧产生激发态氧化型LH2，当其从激发态回到基态时，以发射光谱的形式释放出多余的能量，可用于快速测定肽类等物质。细菌发光系统是在细菌荧光素酶的催化下，需要黄素单核苷酸（FMN）、氧和直链脂肪醛（RCHO）参与的一个复杂的反应过程，其发射的光谱（420～670nm）均在可见光波长范围内。
生物发光技术在临床生物化学和微生物学领域得到广泛应用，如测定体液或血液中的抗生素和维生素浓度，检测血小板功能和细胞β2-肾上腺素能受体，测定细菌的生长和细菌的药敏试验等。还有研究利用化学发光技术建立了一种定量分析PCR产物的新方法，并可用于乙肝病毒（HBV）定量PCR检测。化学发光和生物素切换技术（chemoluminescence and biotin switch assay）的发展迅速，例如，研究蛋白S-亚硝基化（protein S-nitrosylation）很困难，如果采用化学发光和生物素切换技术即可明显提高分析能力和精度。（伍贤平）