精液的细菌、真菌、支原体培养(男科学 精液的微生物学检查)

常用细菌培养基

一、血液琼脂（血平板）

①成分：普通营养琼脂95ml，脱纤维羊血（或兔血）5ml。

制法：将已灭菌的普通营养琼脂（pH值为7.6）加热溶化；冷却至50℃左右，以无菌手续加入脱纤维羊血（临用前置37℃水浴箱预温），轻轻摇匀（切勿产生气泡），倾注于灭菌平皿内，每一平皿（直径9cm）20ml或分装试管，等凝固后，抽样置35℃培养，18～24h，观察有无细菌生长；如无菌生长，置4℃备用。

②成分：哥伦比亚血琼脂，脱纤维羊血。

制法：按说明书称取哥伦比亚琼脂，加蒸馏水溶后，高压灭菌。冷却至50℃左右，以无菌手续加入脱纤维羊血（使其含量为5%），倾注平皿。

二、巧克力色血琼脂（分离嗜血杆菌用）

成分：氯化钠2.5g，蛋白胨5.0g，牛肉粉2.5g，酵母浸膏2.5g，蒸馏水500ml（以上成分亦可用营养琼脂或哥伦比亚琼脂），氯化血红素15mg，25mg/ml万古霉素，7.5g/L辅酶A（NAD）。

制法：称取前4种成分后，加蒸馏水溶解，用少量0.25mol/L氢氧化钠溶解氯化血红素后加入培养基，调pH 7.8，高压灭菌，至60℃左右加入30ml脱纤维羊血，置85℃水浴中摇动10～15min，冷却至50℃左右加入上述浓度万古霉素、NAD各1ml。摇匀后倾注平板，抽样做无菌试验后，4℃保存备用。

三、麦康凯琼脂：分离革兰阴性杆菌用。

制法：按说明书称取麦康凯琼脂，加蒸馏水溶后，高压灭菌，倾注平皿。

四、罗氏培养基：分离结核分枝杆菌用。

成分：磷酸二氢钾（无水）0.96g，天门冬酰胺（天门冬素）0.72g；枸橼酸镁0.12g，硫酸镁（MgSO₄•H₂O）0.048g，纯甘油（中性）2.4ml，蒸馏水120ml，马铃薯粉6.0g，新鲜鸡蛋6～8个，10g/L的孔雀绿溶液8ml。

制法：将前6种成分混合，置沸水中加热溶解；加入马铃薯粉，边加边搅拌，注意勿结成块，并继续在沸水浴中加热30min，同时搅拌；待冷却至65℃时加入全蛋液200ml及10g/L孔雀绿溶液8ml，充分混匀；分装于无菌试管，每管约5～6ml，塞上硅胶塞；斜置血清凝固器内，80℃1h，切断电源放置1d，再加温至80℃1h，如此重复3次。抽样置35℃培养48h，如无菌生长，置2～8℃贮存。

常用真菌培养基

一、沙保弱培养基

成分：蛋白胨10g，葡萄糖40g，琼脂20g，氯霉素0.1g，蒸馏水1000ml。

制法：上述成分混合，加热溶解（一般可不校正pH）分装试管，121.3℃高压灭菌15min，趁热制成斜面。如不加琼脂即为沙保弱液体培养基。

二、念珠菌显色培养基

制法：称取柯玛嘉显色培养基，加蒸馏水后，高压灭菌或煮沸灭菌，冷却至50℃左右倾注平板。在该培养基上白色念珠菌显翠绿色，热带念珠菌显灰蓝色，其他念珠菌显玫瑰红色至无色。

常用溶脲脲原体培养基

一、溶脲脲原体培养液

成分：牛肉浸液70ml（可用进口牛肉粉替代）；蛋白胨1.0g；NaCl 10.5g；KH₂PO₄0.15g；4.0g/L酚红0.5ml。

制法：调pH至6.0，加热溶化后滤纸过滤，121.3℃高压灭菌，无菌加入小牛血清20ml；250g/L鲜酵母浸液10ml（可用进口酵母浸膏粉替代）；青霉素20万单位；400g/L尿素（G6滤器过滤除菌）1.5ml，分装试管，每管4ml。

二、溶脲脲原体固体培养基

将上述培养液每100ml加入琼脂粉1.0g倾注平板即可。

精液中常见细菌、真菌的鉴定程序

细菌培养 以无菌技术将待测精液接种于血平板、巧克力平板，或加上麦康凯平板。接种后的培养基置35℃温箱，在分离培养某些细菌（如淋病奈瑟菌）时，需将已接种的培养基置5%～10%的环境（无培养箱时，可用烛缸代替）。

1. 淋病奈瑟菌：将精液接种于巧克力平板，5%～10%的环境中，35℃培养24～48h后，取生长的可疑菌落涂片革兰染色，油镜下观察是否为革兰阴性、肾形成双排列，并补做氧化酶及糖发酵试验，对初步认定的菌落可先用头孢硝噻吩（nitrocefin）纸片检测β-内酰胺酶，并做规定的抗生素敏感试验，并可进一步用荧光抗体试验等鉴定。
2. 革兰阴性杆菌：取平板上分离的纯菌落，按细菌生化鉴定程序操作，并进行药敏试验。
3. 葡萄球菌及链球菌：根据涂片、染色检查结果做血浆凝固酶、O/F、杆菌肽、Optochin等试验鉴定。
4. 厌氧菌培养：按厌氧菌培养的要求收集标本，并立即送厌氧培养。
5. 结核杆菌培养：标本收集后，自行液化接种于罗氏培养基，置35℃培养约2个月，培养期间每周观察结果。发现可疑菌落，作涂片抗酸染色确认。
6. 真菌培养：取精液接种于沙保弱培养基或念珠菌显色培养基进行培养鉴定。

精液的溶脲脲原体培养

溶脲脲原体除能引起非淋菌性尿道炎外，还可导致不育、自发性流产和死胎。有作者对330例生育和不育男性精液标本进行溶脲脲原体检测，发现不育男性溶脲脲原体检出率（66.1%）高于生育男性（23.6%）。分离培养方法为用无菌滴管吸取精液0.1ml，接种于培养液内，每份标本接种2支。置35℃含5%CO₂培养箱或烛缸内培养。分别于24、48、72h观察结果；如溶脲脲原体生长，则水解尿素，使培养基pH升高，液体变红色。再将此液用0.45μm微孔滤膜过滤，滤液转种1支培养液中，仍出现阳性反应，且液体澄清，可确定为溶脲脲原体。将培养悬液转种于平板培养基上，观察集落形态。取培养悬液沉淀或集落涂片，染色后观察溶脲脲原体形态。

精液溶菌酶含量测定

精液溶菌酶（lysozyme）含量可反映机体防御功能及其所在组织器官炎症程度。精浆中溶菌酶含量可以作为男性生殖道感染的诊断指标。

一、检测方法

将腐生微球菌菌粉用pH 6.6PBS配成1g/L悬液，通过Sharp UT302R机3min，达成完全乳化。1g/L乳化菌液加等量已溶化的20g/L琼脂混匀浇板，凝固后打孔，孔径3.5mm，孔距11.5mm。将待测精浆10μl加至孔内，37℃温盒扩散6h。用游标卡尺测量溶菌环直径（mm），从标准曲线换算得溶菌酶浓度（mg/L）。

二、标准曲线制作

将溶菌酶标准品稀释成不同浓度（5、10、20、40、60、80、100、200mg/L），按上法操作，每个浓度设3～5个复孔，测得溶菌环后，算出均值。在半对数纸上，以溶菌酶浓度为纵坐标（对数），溶菌环平均直径为横坐标，制作标准曲线。

三、正常参考值

正常生育男性的精浆：（38.7±20.1）mg/L，范围：4.6～109.1mg/L。