乳腺癌干细胞的生物学特性(乳腺肿瘤学 干细胞与乳腺癌)
肿瘤细胞是癌症的基础，其起始细胞可促进肿瘤发展，并伴有癌基因和抑癌基因的突变，因此癌症被认为是一种基因疾病。传统观念认为肿瘤细胞是由同源性的细胞组成，直到肿瘤进展的时候，因为增殖而出现基因突变、遗传不完整的细胞亚群，从而促进肿瘤转移。这些克隆的异质性导致肿瘤的组织病理学多样性，包括不同程度的分化、增殖、血管形成、炎症及侵袭。但是，最新的观察发现肿瘤细胞并非一群同源性细胞，它们是有异质性的。肿瘤干细胞最早用于描述造血系统的恶性疾病，多年后将其移植于实体瘤如乳腺癌和神经外胚层肿瘤。由于肿瘤干细胞的发现，导致对肿瘤的生物学行为有了新的认识。曾经认为肿瘤生物学行为是与肿瘤细胞的总体有关，现在必须思考是否与某一亚群的细胞有关，即肿瘤干细胞和非肿瘤干细胞。而这里的肿瘤干细胞，并非等同于正常细胞的干细胞，而只是一群特殊的具有肿瘤启动潜能、具有自我更新能力并可分化出非肿瘤细胞能力的肿瘤细胞。因为现在某些高度恶性癌症的生物学行为，已经可以特异性地追溯到类似肿瘤干细胞的特性。在许多肿瘤细胞里，干细胞的比例是很小的，但是，它可以促进肿瘤的恶性进展。
许多基质细胞被肿瘤细胞募集到周围环境中，这不仅增强了原发肿瘤的成长，也为转移到远处器官提供了条件。肿瘤细胞在原发肿瘤灶里倾向于改造自身存活的微环境，一旦离开了合适的环境，它们必须获得一些可以使其在新环境中生存的一些特征。为了可以让转移发生，血管内的肿瘤细胞必须在循环系统里存活，到达远处器官组织，离开血管进入间质的时候能持续性生长。每个步骤的效率是很低的，甚至是限速的。例如，肿瘤细胞的老化和凋亡，可以阻止大部分的循环肿瘤细胞（CTC）进入转移部位。种植可以发生在多个器官，但是，肿瘤的转移灶只能在一个或者少数几个器官组织中存活。也有证据表明，一些肿瘤细胞可以处于休眠状态许多年，而种植则发生在原发肿瘤被初次诊断的好几年前。另一种现象叫血管源性冬眠，这是微小转移灶增殖与凋亡平衡的结果，并不会发生进展。微环境明确抑制了有转移潜能的肿瘤细胞，微环境的不稳定可以再次激活临床相关的肿瘤转移。除了有证据表明早期种植、肿瘤细胞冬眠、肿瘤大小和级别都是转移的主要预测因素外，通过基因表达分析发现肿瘤大小跟转移相关基因印迹有关联。转移灶的形成依赖于肿瘤细胞累积的结果以及合适的微环境，转移过程的每个环节都很重要，包括原发肿瘤、循环系统及最终的转移灶。
乳腺癌干细胞与转移
乳腺癌干细胞被定义为在合适的动物模型上具有种植成瘤的能力。尽管发现了肿瘤干细胞，但是肿瘤之间的差异还是很大的。肿瘤细胞可以种植在两三个不同的地方，只有其中一个部位可以发展为肿瘤，这些分化而来的肿瘤细胞，经过细胞特异性标记抗原标记，由荧光激发的细胞筛选后发现，肿瘤启动细胞的数量变化很大，但肿瘤干细胞的转移特性很明显，即肿瘤细胞种植的动物模型，就是模拟了播散的肿瘤细胞并在肿瘤中启动；这些癌细胞具有肿瘤干细胞特性，可以分化成肿瘤子细胞。所以，肿瘤干细胞的特征可以定义为自我更新和肿瘤启动能力，而这两个特性则是转移发生的不可或缺的条件。
而肿瘤干细胞的其他特性，如高运动性、高侵袭性、高抗凋亡性，对于肿瘤转移的研究相对较少。这意味着，乳腺癌转移是一个多层面协调的细胞程序性行为，肿瘤干细胞促进原发肿瘤转移需要多步骤的侵袭转移信号的刺激。
乳腺癌干细胞与EMT
在过去30年，发育生物学家发现了一个细胞生物学的程序——EMT，在胚胎早期形态学的形成过程中起了很重要的作用。EMT的过程由EMT诱导的转录因子介导，并发生一系列形态学的变化，使得细胞的上皮表型转变为间质表型。重要的是，在胚胎发育中EMT是不可逆的。所以，细胞的转变被认为是一种间质表型的改变，通过间质-上皮转化（MET）被逆转成上皮状态。
最新的研究证明，EMT可以诱导非肿瘤干细胞成为肿瘤干细胞样的状态。例如，EMT给予上皮细胞准确的特征，可以让原发细胞获得播散的能力并能种植转移，所以，对于其转移播散的研究是很有吸引力的。同时，EMT可提高原发肿瘤抗失巢凋亡的能力，后者与肿瘤存活活性高度相关。另外，肿瘤细胞的干细胞样状态可以通过EMT促进肿瘤细胞迁移到新的地方形成肿瘤细胞克隆。但是，EMT不是肿瘤细胞转移的唯一途径，也许还有未发现的细胞生物学程序成为特定癌细胞的恶性驱动因素。
肿瘤形成过程中的EMT激活，需要肿瘤细胞与基质细胞之间信号的转导。在恶性程度高的肿瘤细胞里，肿瘤细胞募集了一些间质细胞，如成纤维细胞、成肌纤维细胞、粒细胞、巨噬细胞、间质干细胞和淋巴细胞。这些被募集而来的细胞会形成一个“反应性”的基质环境，事实上就是一个炎症微环境，正是这个环境释放了诱导EMT的信号。这些肿瘤细胞接受信号后并激活表达转录因子，执行一系列的EMT程序。
这些情况提示，激活EMT需要两个重要的信号来源。第一是肿瘤细胞自身的生物学特性，即可接收EMT信号，在其变形以前可产生一系列的遗传学和表观遗传学改变肿瘤细胞；第二，反应性间质诱导信号的释放作用于可反应的肿瘤细胞，导致其产生EMT转录因子，以激活潜在的EMT程序。如果通过这种方式激活，EMT相关的特征就不是原发肿瘤的遗传学和表观遗传学的进化产物；相反，表现为在肿瘤一旦形成的时候接受相关信号刺激以后的适应性表现。
EMT看上去像一个概念，其促进转移播散的机制还有很多地方不明确，部分是因为技术上很难捕捉到患者身上的转化过程。同时，EMT只发生在少数肿瘤细胞内，并需要与相应的反应性机制接触。这意味着EMT不可以通过检测未分选的肿瘤组织基因组的改变而被发现。
尽管EMT被理解为两种状态的转变，但是，生物学的特性显示更为微妙。在许多肿瘤中，上皮肿瘤细胞看上去只有部分会转为间质状态，这些肿瘤细胞同时表达上皮和间质标记，而这些状态在正常细胞里是不会持续的。也许这些特性可以作为检测EMT的方法。
乳腺癌干细胞与CTC
许多局部晚期患者血液中含有CTC，最起码有少数可以从原发肿瘤转变为未来的转移灶。这些CTC提供了细胞在循环系统存活的模型。更重要的是，CTC的出现和穿出血管，以及乳腺癌患者骨髓中发现的播散肿瘤细胞（DTC），与转移负荷增加、高度恶性疾病、复发转移时间呈正相关。
从更长远看来，CTC和DTC的生物学特性是非常有用的诊断和预后指标。这些细胞是否有重要的致病机制，现在还不知道。例如，发现大量的CTC仅仅反映了原发肿块的高度恶性，并不表现原发肿块跟转移灶之间的关联。
笔者对于CTC的理解是，它们在转移播散中扮演的角色依然很不明朗，包括一些没有解决的生物学问题和检测这些稀有细胞的技术问题。CTC的直径20～30μm，相对于毛细血管的直径（8μm）来说大很多。在离开原发肿瘤进入静脉循环的时候，CTC在第一次经过心脏时，可以被阻滞于这些毛细血管。但是，这些存活时间长于半衰期（1～2.4小时）的细胞，提示它们可能是特别小的或者是可变形的CTC，以至于它们可以躲避被肺毛细血管捕获的可能，并在血液里形成稳定的浓度。如果CTC是以多细胞簇的形式存在，直径同时增大很多，必定会马上种植在微小血管里，并在循环系统里有很短的半衰期。这些CTC，用现有的方法是无法计数的。
另外，单个肿瘤细胞表面表达的组织蛋白因子会使血小板聚集，增加CTC的直径。这意味着在血液循环里发现的CTC可以表现为特殊的肿瘤细胞亚群，在某种意义上并不会触发血小板凝集。这些血小板黏附增加了CTC被发现的困难，因为其表面标记会被遮盖。
上皮特异性表面标记是广泛用于发现CTC的手段。但存在一个潜在的问题，因为它很有可能经过了部分的或者是全部的EMT状态，不能通过上皮标记而被发现。CTC的富集通过CD45剔除血细胞，可以成为一个替代的方法。
除了这些问题，CTC从循环系统的分离可以成为研究迁移性肿瘤干细胞的研究模型，特别是那些从肿瘤干细胞分化而来并重新种植在原发肿瘤灶的细胞。同时，提供了一个可以前瞻使用的预后指标，即监测肿瘤患者的纵向CTC浓度，肿瘤科医师可以判断对于原发肿瘤治疗的效果。
CTC在微血管床停留，可以穿出血管并侵入间质，或者可以在管腔内生长，最终突破微血管外膜。转移的形成对于某些器官的偏爱，与毛细血管的差异有关系。例如，骨髓毛细血管窦由单层内皮细胞形成并缺少壁细胞，这方便了正常的血液营养运输。但是，同时对癌细胞的侵袭抵抗性差。这也可以解释为什么骨骼是一个常见的转移器官。
器官特异性种植也是一个活跃的过程，组织和肿瘤特征决定了转移播散。肿瘤细胞表达转移性的蛋白如整联蛋白（integrin），对肿瘤的转移指数过程有重要的作用。因此，肿瘤的转移可能由细胞介导的黏附和远处转移器官的微血管所决定。
乳腺癌干细胞与微环境
已经发现，在原发肿瘤里除了肿瘤细胞以外还有很多间质细胞。已经证明与肿瘤进展有关的间质细胞包括内皮细胞（即脉管系统）、外周细胞、成纤维细胞，以及骨髓源性细胞如巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞、骨髓源性抑制细胞和间质干细胞。
早期肿瘤中出现的免疫细胞被认为是杀伤肿瘤细胞失败的免疫细胞。肿瘤不但有效地逃过了免疫系统介导的杀伤，还可改变炎症细胞的类型，从而促进肿瘤的转移。许多免疫细胞的浸润与癌细胞抗原识别没有什么关系，可能与组织破碎后导致的炎症因子有关，这是肿瘤细胞伴有慢性炎症的有力证据。初始的炎症环境不缓解，就会持续性地募集骨髓源性炎症细胞到肿瘤细胞处。所以，慢性炎症状态可以建立一系列的促肿瘤信号，这些信号分子与正常的组织修复因子类似。但是，没有一个特定的或者是固有的免疫细胞类型与肿瘤的恶性程度或预后有很明确的关系，甚至在独立的细胞类型中也有相反的功能。例如，CD4+T细胞、巨噬细胞和自然杀伤细胞（NK细胞），在组织接触和细胞刺激下都有肿瘤抑制或者是肿瘤促进的作用。
经典的免疫细胞分化状态或者亚型有不同的功能。例如，Th1（1型CD4+T细胞）可帮助CD8+T细胞对肿瘤执行免疫排斥，同时Th2（2型CD4+T细胞）和CD4+T调节细胞可以阻止CD8+T细胞的激活。最近很多研究发现，特殊的免疫细胞浸润与肿瘤预后有关。例如，CD8+T细胞和树突状细胞与结直肠癌和头颈部肿瘤有关；巨噬细胞的浸润，与80%的癌症预后有关系，与乳腺癌、甲状腺癌、胆囊癌的转移呈正相关。
诱导血管生成，对实体肿瘤早期阶段的发展很重要，也是肿瘤细胞血液播散的必要途径。骨髓源性细胞包括巨噬细胞、表达TIE-2的单核细胞、中性粒细胞和肥大细胞，都是通过它们的生长因子、细胞因子和蛋白酶起作用，如血管内皮生长因子A（VEGFA）、PROK-2和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMP）。
肿瘤相关巨噬细胞
巨噬细胞是典型的骨髓源性细胞，可以调控肿瘤细胞的行为，动物模型中证明其可以促进肿瘤血管生成、侵袭、血管内渗和转移。巨噬细胞是天生可变形细胞，这些适应性是肿瘤细胞诱导的或者是其固有的功能，它可以促进不同阶段的肿瘤进展。尽管巨噬细胞的分类可以提示肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophage，TAM）的功能，但是对于单个巨噬细胞活动的复杂性以及相关分子信息的了解并不多。特别是肿瘤抑制和肿瘤促进的平衡控制，如何促进肿瘤进展，至今还不清楚。已经知道有多种TAM的亚群在肿瘤中起作用，它们会在肿瘤的发展和不同的肿瘤中，发生适当的临时改变。例如，TAM会被募集到厌氧区域，抑制肿瘤的血管生成；同时，TAM和肿瘤基质的接触则可促进肿瘤的侵袭和血管生成。
多数研究证明巨噬细胞调控肿瘤进展是通过遗传学调控的，如Csflop/op小鼠，是巨噬细胞集落刺激因子-1（colony stimulating factor-1，CSF-1）缺陷小鼠，或者是药理学删除，如脂质体双膦酸盐处理，可以选择性杀死巨噬细胞，这些都会导致巨噬细胞浸润减少，从而抑制不同动物模型肿瘤血管的生成、肿瘤生长及转移。尽管这些实验已经证明巨噬细胞在肿瘤产生前期的功能，但是不可否认去除全部巨噬细胞而产生的差异巨大的结果。另一个替代方法就是去除某一亚群或者巨噬细胞产生的独立因素。这个策略最近用于特异去除VEGFA的MMTV-PyMT乳腺癌模型。虽可降低肿瘤血管生成，但是却加速肿瘤的进展。在这种小鼠模型中肺转移是否增加并未见报道，但为微环境靶向治疗提出了一些担忧。
另一个TAM促进肿瘤侵袭的机制是TAM的EGF旁分泌环路促进表达EGFR邻近的乳腺癌细胞的侵袭转移。肿瘤细胞分泌CSF-1，这是一个潜在的趋化因子，可募集CSF-1受体（CSF-1R）表达的TAM。这些信号的交互作用可以被EGFR或者是CSF-1R的抑制剂所阻断，包括降低肿瘤细胞和巨噬细胞的侵袭和迁移。肿瘤细胞的侵袭可以由其他因子启动，例如神经调节蛋白-1在MMTV-PyMT小鼠乳腺癌模型中导致乳腺上皮特异性表达ErbB-2癌蛋白，或基质细胞驱动因子-1（SDF-1，或CXCL-12）。但是，这些肿瘤的迁移需要巨噬细胞，通过EGF和CSF-1信号转导并与肿瘤细胞交互作用。所以，在原发肿瘤里应该有一个侵袭性的环境（invasive niche）存在，可促进肿瘤细胞、巨噬细胞和内皮细胞建立一个信号分泌旁路，导致肿瘤的渗透和播散。乳腺癌研究中发现的3种细胞簇被称为肿瘤转移微环境（tumour microenviroment of metastasis, TMEM），它们的密度与远处器官的转移有密切关系。
TAM与炎症因子
TAM可以影响肿瘤的进展和转移，但其相关机制不明确。一些生长因子和细胞因子都可以促进肿瘤转移。例如，VEGFA、转化生长因子-β（TGF-β）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）都可以促进肺内皮和髓细胞表达S100-A8和S100-A9），从而促进侵袭和循环肿瘤细胞的黏附，形成转移性环境（niche）。
TNF-α在一些研究中提示促进转移，它可以上调内皮细胞的一些黏附分子从而促进迁移和黏附，包括E-选择素、P-选择素和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）。TNF-α也可以保护NK细胞的攻击。TNF-α信号通过转录因子NF-κB，以及巨噬细胞的聚集产生炎症微环境，从而促进肿瘤细胞转移。Karin及团队发现条件性介导的细胞外基质的多功能蛋白聚糖的激活，使TNF-α产物对巨噬细胞激活Toll样受体-2（Toll-like receptor-2, TRL-2）和TRL-6。
TAM分泌CCL-18，主要在血液和肿瘤间质中表达，与患者的转移高、预后差有关。TAM释放CCL-18，可以促进整联蛋白的聚集，从来增加肿瘤细胞的侵袭和对细胞外基质的黏附，并通过PITPNM3受体而发挥作用。沉默PITPNM3，可以在动物模型中逆转CCL-18促转移和侵袭的能力。
间质干细胞
间质干细胞（mesenchymal stem cell, MSC）是一种存在于骨髓细胞，尽管不是骨髓来源的，但具有多项潜能，可以分化为骨母细胞、软骨细胞、脂肪细胞和其他间质来源的细胞。MSC在原发肿瘤里数量较多，因此MSC可以作为一种药物载体，将药物准确导入到肿瘤中。最近，Karnoub研究MSC在原发肿瘤处是否介导和调控邻近的肿瘤细胞。他们发现将人MSC与低转移乳腺癌细胞混合以后，可以显著增加癌细胞播散到肺。但是，其他间质细胞未发现类似现象。有趣的是，MSC对于肿瘤细胞的诱导是在原发肿瘤发生的，从而促进了肺转移。乳腺癌MSC分泌CCL-5及其受体，形成一个旁分泌轴。尽管MSC的刺激效应很短，没有明显促进转移灶生长，但是它可以增加转移灶个数。这些实验证明，MSC可以与肿瘤细胞接触，并改变它们的表型，其中肿瘤细胞释放募集MSC的信号的确认很重要，这是一个潜在的治疗靶点。同时证明MSC是在骨中找到的干细胞，其有潜力获得特异的分化潜能和不同的肿瘤微环境。