乳腺癌蛋白质组学的研究技术和方法(乳腺肿瘤学 乳腺癌基因组学与蛋白质组学)

双向凝胶电泳

Farrellpo于1975年建立了双向凝胶电泳（2-DE）技术。他们利用等电聚焦（IEF）与十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）联合的2-DE分离大肠埃希菌中的蛋白质。该技术又称为双向聚丙烯酰胺凝胶电泳（2D-PAGE），是蛋白质分离的核心技术。其第一相是使用固相化pH梯度胶条进行等电聚焦电泳，分离等电点不同的蛋白质。第二相是SDS凝胶电泳。由于带负电的SDS可与蛋白质多肽链结合，掩盖了蛋白质原有的电荷差别，可分离不同相对分子质量的蛋白质。

目前，2-DE技术克服了载体两性电解质引起的凝胶时间延长、梯度不稳和阴极漂移等现象，稳定性和可重复性得以明显改善。一张2-DE图谱已经可以分辨10 000多个蛋白质斑点。2-DE技术在阐明乳腺癌潜在的发生机制，寻找与诊断、治疗、预后、耐药等有关分子靶标的研究中占有重要地位。目前常用的样本主要有乳腺癌组织、细胞株、乳头吸出液、细胞间质及血清等。

质谱分析

质谱分析（MS）是对分离的蛋白质样品进行鉴定的核心技术之一。常用的方法有基质辅助激光解吸附电离质谱（MALDI-MS）、电喷雾电离质谱（ESI- MS）。这两种质谱分析方法可成功地用于蛋白质等生物大分子相对分子质量的测定、肽图的测定、蛋白质和多糖序列以及翻译后修饰的测定等方面。

在MALDI基础上进行改进和发展的表面增强激光解析离子化-飞行时间-质谱技术（SELDI-TOF-MS），其最大的特色是样本无需进行精细分离，粗样本可直接滴加到表面经过特殊修饰的芯片上，即可同时检测几千种蛋白质，还可以发现样本中许多被掩盖的低浓度蛋白质，增加发现生物标记的机会。所以，SELDI-TOF-MS技术更加适用于乳腺癌的研究，是近年来发展的最新技术，具有高灵敏度、高准确率、自动化等优势。

质谱分析得到肽质指纹图（PMF）和肽序列标签（PST）后再进行数据库的搜索，从而实现对蛋白质的定性、定量鉴定。值得一提的是，SELDI技术无需2-DE预先分离蛋白质，直接从样本中同时检测几千种蛋白质，检测灵敏度高，可快速找出新的肿瘤标记。SELDI本质上是一种非标记质谱方法，在通过其获得的图谱中，峰高成为定量的要素。

组织芯片

组织芯片（tissue chip）是可同时列阵数十至上百种不同肿瘤组织的点阵。一个芯片蜡块的连续切片可同时进行免疫组化、荧光原位杂交、mRNA原位分子杂交等方法的分析。在乳腺癌蛋白质组学研究中，组织芯片主要用于乳腺肿瘤分子标记的分析，也用于对肿瘤的某些亚型进行划分。

蛋白质芯片

蛋白质芯片（protein chip）的基本原理就是将蛋白质探针列阵于芯片表面来检测标本中特异性蛋白质。目前最先进的蛋白质芯片为抗体芯片，它是将特异性抗体作为诱饵列阵于固相载体的表面，待分析的蛋白样品用荧光标记或者不标记而通过与二抗的结合作用将其探测出来。为了更好地识别乳腺癌组织中的特异性蛋白质，有人将患者的乳腺正常组织与乳腺癌组织中的蛋白分别用两种不同的荧光染料进行标记。现在已有商品化的抗体芯片，可同时检测到378种不同的蛋白质。抗体芯片目前已经用于高危乳腺癌患者蛋白质组学研究，检测出许多与乳腺癌演进过程中微环境调节相关的蛋白质。

生物信息学技术

生物信息学是以生物大分子为研究对象，运用数学和信息学的观点、理论和方法去研究生命现象，组织和分析庞大且呈指数级增大的生物信息数据的一种研究方法。在蛋白质组学研究中生物信息学的核心是蛋白质数据库，主要的蛋白质数据库有 SWISS-PROT/TrEMBL、 Protein Infommtion Resource（PIR）、NCBInr、dbEST、OWL等；蛋白质组相关数据库有AAindex、GELBANK、Predictome、Pmteome Analysis Datebase等；蛋白质序列基序数据库有Blocks、CIuSTr、CDD、InterPm等。近年来还出现了一些蛋白质三维结构相关的数据库。