骨与胶原蛋白(内分泌学 代谢性骨病与软骨病)

骨组织与其他组织不同，细胞成分少而基质成分多。骨基质（细胞外基质，ECM）的主要成分为骨的有机物质，去除骨矿物质后的ECM主要由骨胶原纤维组成。胶原蛋白（collagen proteins）可分为微纤维状（fibrillar）和非微纤维状（non-fibrillar）两类。ECM是细胞分泌物质的贮存处，ECM分子之间以及ECM与细胞之间的作用十分广泛而复杂，在各种疾病的病因、发病机制和防治中具有重要的意义。

短链胶原为非微纤维状胶原中的一种，主要有Ⅷ型和Ⅹ型胶原，两者在结构和功能上有许多相似之处。Ⅷ型胶原由迅速增殖的细胞分泌，主要分布于基膜，其功能是作为一种分子桥（molecular bridge）在不同类型的基质分子间起连接作用，同时也参与膜稳定性、血管生成和ECM各组分相互作用等过程。Ⅹ型胶原主要由肥厚型软骨细胞（hypertrophic chondrocytes）合成，一般仅见于骺软骨生长板中的肥厚带（hypertrophic zone），与骨的矿化、软骨内骨化及血管生成等功能有关。

骨胶原蛋白的甘氨酸残基含量占1/3，脯氨酸和羟脯氨酸残基占1/5以上，这一序列特点使胶原的α链成为极稳定的三螺旋（triple helix）分子。在生物体内，由25种α链构成14种不同类型的胶原分子。

Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型、Ⅴ型和Ⅺ型胶原蛋白组成胶原微纤维（fibrillar collagens）。这些微纤维是骨骼、皮肤、血管、肠管、器官内纤维囊膜的主要结构蛋白质。Ⅰ型胶原主要存在于骨、肌腱、韧带和皮肤组织，Ⅲ型胶原主要存在于血管。一般含有Ⅰ型胶原的组织也含有Ⅴ型胶原，而Ⅱ型胶原主要存在于软骨组织（还含有Ⅺ型胶原）和晶状体中。Ⅸ型、Ⅻ型和ⅩⅣ型胶原亦称为微纤维相关性胶原（fibril-associated collagen，FAC）或间断性三螺旋微纤维相关性胶原（fibril-associated collagen with interrupted triple-helices，FACIT）。FACIT主要协调微纤维胶原之间、胶原与其他细胞基质之间或细胞与细胞之间的相互作用。Ⅸ型胶原分布于Ⅱ型胶原微纤维的表面，并与其形成共价交联结构，Ⅻ型和ⅩⅣ型胶原与Ⅰ型胶原分子的作用有关。此外，ⅩⅥ型与Ⅺ和Ⅸ型胶原也属于FACIT家族的成员。

Ⅰ型胶原组成骨骼基本构架

Ⅰ型原胶原

Ⅰ型原胶原（procollagen）的三螺旋由2 条α₁链和1条α₂链［α₁（I）2-α₂（I）］组成，极少由3条α₁链［α₁（I）₃］形成。在三螺旋的N端为N末端肽（N-telopeptide）及N-前肽（N-propeptide）；而C端为C末端肽（C-telopeptide）及C-前肽（C-propeptide）。成骨细胞分泌的Ⅰ型原胶原在基质中被迅速裂解（下图），脱下N末端肽与C末端肽。成熟的Ⅰ型胶原分子组装成微纤维，胶原分子平行排列，两重叠链的距离为67nm（称为1个间距D），分子长度为4.4D（300nm），两分子的头、尾间隙为0.6D（40nm）。一般由微纤维再形成纤维束。

Ⅰ型胶原的分子结构

注：Ⅰ型胶原分子由胶原三螺旋区、N末端肽（N-telopeptide）、C末端肽（C-telopeptide）、N端前肽（N-propeptide）、C端前肽（C-propeptide）组成。处表示成熟Ⅰ型胶原分子的裂解位点。

编码Ⅰ型胶原的α₁链［α₁（I）］基因定位于17q21.3-q22，编码α₂链［α₂（I）］的基因位于7q21.3-q22。此两个基因的结构相似，但长度不同，α₁（I）基因长18kb，α₂（I）基因为38kb，见下图。差异的原因是内含子数目不同。α₁链的三螺旋区的序列由第41号外显子编码（Gly-X-Y重复序列），而α₂链的三螺旋序列由第42号外显子及2个参与外显子（joining exons）编码。α₁链的C前肽与C末端肽由48～51号外显子编码，而α₂（I）基因的第49～52号外显子编码α₂链的C末端肽和C前肽。N末端肽和N-前肽及信号肽由第1至第6号外显子编码。

COL1A1基因、基因产物及其调节

注：COL1A1基因含51个外显子。基因中含SP1、VDR和NF1反应元件。VDRE：维生素D受体反应元件；NF1：核因子1。COL1A1基因表达产生两种mRNA。基因中的反式作用元件和多聚酶激活元件分别受维生素D受体和CAAT-结合蛋白的调节。

COL1A2基因结构、表达产物及其调节

注：COL1A2基因含52个外显子和1个增强子。基因中含核因子1（NF1）结合位点和CAAT结合蛋白结合位点。COL1A2基因表达产生两种mRNA。基因中的顺式作用元件和多聚酶激活元件分别受NF1反式作用因子和CAAT-结合蛋白的调节。NF1：nuclear factor 1，核因子1。

Ⅰ型胶原基因突变导致骨脆性增加，临床上主要表现为成骨不全（osteogenesis imperfecta，OI）。约90%的成骨不全是由于前α1（Ⅰ）基因或前α2（Ⅰ）基因突变所致。

微纤维蛋白

微纤维蛋白（fibrillin，FBN）是骨骼、眼睛和血管胶原微纤维中的基本组分，其结构尚未完全确定。分子中可能含8个EGF样基序、1个RGD结合区、数个含半胱氨酸残基的基序。FBN基因突变引起马方综合征（Marfan syndrome）、常染色体显性遗传性脊柱后侧凸畸形（G1796E）、二尖瓣-主动脉-骨骼-皮肤（mitral valve-aortaskeleton-skin）综合征（MASS syndrome）。

基质金属蛋白酶水解骨胶原并调控骨代谢

在生理条件下，基质金属蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和MMP-8将三股螺旋结构的Ⅰ型胶原分解为1/4和3/4长度的明胶片段，后者再被MMP-2、MMP-9降解。基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（tissue inhibitor of MMP-1，TIMP-1）能抑制所有的MMPs活性，基质金属蛋白酶组织抑制因子-2（TIMP-2）主要抑制MMP-2，也抑制其他MMPs。骨组织的MMPs和TIMPs主要来源于成骨细胞，少部分来源于破骨细胞，其分泌量和活性受多种激素和细胞因子的调节，从而形成骨基质代谢的另一套局部调节系统，调控着骨有机质的合成、分解、构塑、重建。MMPs由5部分（信号肽区、前肽区、含高度保守锌离子结合位点的降解区、交联区和凝血酶样区）组成。MMP-1（胶原酶-1，collagenase -1）、MMP-8（胶原酶-2）、MMP-13（胶原酶-3）是Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型胶原的主要降解酶。经裂解成1/4和3/4片段的Ⅰ型胶原被MMP-2、MMP-9进一步裂解。基质分解素（stromelysin）降解Ⅳ型胶原和纤连蛋白，MMP-7和MMP-12可降解弹性蛋白（elastin）。

TIMP家族由TIMP-1、-2、-3和-4组成，相互之间有30%～40%的同源性，含12个保守半胱氨酸残基。TIMPs可抑制所有MMPs的活性，但不同的MMPs只能分解相应的特异性细胞外基质。成骨细胞可表达MMP-1、-2和-3及TIMP-1和-2；破骨细胞主要表达MMP-9及少量的MMP-1、-3 和-14。我们用RT-PCR法检测人的成骨肉瘤MG-63细胞株和正常成人成骨细胞的MMPs和TIMPs；在非脱钙的骨切片中，可见成骨细胞表达MMP-13，而且发现两种细胞均可表达MMP-1及MMP-2、-7、-10、-11、-14、-15、-16和-17，亦可表达TIMP-1、-2和-3；雌激素和孕激素对它们的表达有调节作用。因此，在生理情况下，正常的成骨细胞所表达的MMPs能够降解所有的骨基质。骨组织表面的被覆层由成骨细胞和未矿化的Ⅰ型胶原等构成屏障，阻止破骨细胞的活化，避免其与矿化骨基质接触，从而抑制了骨吸收。当成骨细胞在接受了某些耦联信息后，表达的MMPs降解未矿化的Ⅰ型胶原，并进一步激活破骨细胞，启动骨吸收过程。因此，成骨细胞表达的MMPs和TIMPs在骨吸收和骨基质降解过程中起着重要的调节作用。

经反复实验及多年研究，我们应用转基因细胞技术和表达谱基因芯片技术以及细胞原位杂交、免疫组化、骨形态计量、RT-PCR、Northern杂交、Western杂交、Gelatin酶谱分析等技术，用E₂干预，检测被干预细胞的基因及其蛋白质表达的变化，从细胞和分子水平研究了PMOP的发病机制。其主要内容有：

1. MMP-TIMP和雌激素缺乏致骨丢失的关系。雌激素缺乏导致成骨细胞和破骨细胞的MMP-TIMP酶系分泌紊乱和功能失常，表现为骨形成不足和骨吸收增加，最后导致骨丢失。
2. MT1-MMP的功能。MT1-MMP为调节骨吸收与骨形成的重要中介因子，PTH、1，25-（OH）₂D、E₂等可通过调节成骨细胞的MT1-MMP表达，进入核因子-κB受体活化因子配体（RANKL）信号通路，致RANKL表达改变。MT1-MMP蛋白分解区能降解细胞外基质，抑制成骨细胞在骨基质上的黏附，诱导成骨细胞凋亡。
3. TIMP-1的功能。首次发现TIMP-1为骨代谢的重要调控因子，TIMP-1基因可通过保护成骨细胞凋亡，促进成骨细胞增殖、诱导成骨细胞分化，促进骨形成。

然而，雌激素对成骨细胞的MMP-2、TIMP-1 mRNA的表达无影响，提示雌激素主要是通过调控MMP-1的表达来调节骨吸收。在正常情况下，MMP-1降解Ⅰ型胶原及其他骨基质蛋白。其分解的Ⅰ型胶原片段可被MMP-2进一步降解，而TIMP-1则抑制MMP-1和MMP-2的活性，抑制骨基质降解。雌激素抑制MMP-1表达，达到了抑制骨吸收和防治骨质疏松的目的。MMP-TIMP系统在骨代谢中的作用及其与雌激素等的关系见下图。

MMP-TIMP在骨代谢中的作用及其与雌激素的关系

注：E₂缺乏使成骨细胞MMP-1表达增加，降解Ⅰ型胶原屏障，激活破骨细胞，促进骨吸收。E₂缺乏致MT1-MMP表达下调，TNF-α促进破骨细胞的生成和活性，骨吸收增加。MT1-MMP减少时，因RANKL增加而促进骨吸收；亦因TGF-β活化减少而抑制骨形成。TIMP-1表达下调时，通过JNK与PI3激酶途径促进成骨细胞凋亡，骨形成下降。OB：成骨细胞；实线：兴奋；虚线：抑制。

骨胶原蛋白突变导致骨-软骨疾病

目前发现，骨和软骨中的Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅸ型、Ⅹ型和Ⅺ型胶原基因突变可引起骨和软骨的各种病变。一些与胶原纤维的结构和功能有关的蛋白，如软骨基质寡聚蛋白（cartilage oligomeric matrix protein，COMP）的突变也导致骺软骨发育不良症。此外，微纤维蛋白（fibrillin-1，FBN1）是骨骼胶原原纤维的一种基本组分，FBN1突变导致马方综合征和类马方综合征。

随着研究的深入，人们还将发现大量的骨胶原基因变异所致的疾病。例如，Ⅰ型胶原基因多态性是众多遗传性因素中的一种，是决定个体BMD和骨质量的候选基因。Ⅰ型胶原基因突变引起成骨不全。此外，由于软骨中的胶原韧性较差（遗传所致），胶原和蛋白糖苷等非胶原蛋白的代谢差异，造成机械性损伤和胶原分解，引起骨关节病。

软骨寡聚体基质蛋白（COMP）为一种同五聚体蛋白糖苷，由软骨合成。COMP突变导致常染色体显性遗传性假性无软骨发育症（pseudoachondroplasia，PSACH）及多发性骨骺发育不良症（multiple epiphyseal dysplasia，MED）。