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基因结构研究(内分泌学 内分泌代谢研究技术)

导语:基因结构研究属于内分泌学下的内分泌代谢研究技术分支内容。本篇围绕内分泌学 基因结构研究主题,主要讲述基因结构等方面医学知识。

一系列特异性作用于DNA和RNA酶的发现使分子生物学技术发展很快。使用这些酶为工具,特定的DNA片段可以多种来源重复获得,不同来源的DNA片段可通过重组DNA技术来产生新的DNA分子,使用这些技术可确定感兴趣基因的结构和功能,并鉴定出内分泌疾病的相关新基因。

DNA物理图谱特异性标记/ DNA酶学操作底物

限制性酶切位点提供DNA物理图谱特异性标记/ DNA酶学操作底物。限制性内切酶(restriction endonuclease,RE)能识别短的DNA序列,一般识别序列的长度为4~6个碱基对,通过识别序列内或旁侧序列而特异性切割双链DNA,从而得到不同长度的DNA片段。限制性内切酶的发现是许多其他分子生物学技术发展的突破口。首先,限制性酶切割位点提供了获得DNA物理图谱的特异性标记;其次,酶切产生的特异性片段可用分子克隆的方法加以纯化;最后,酶切产生的片段为各种各样的DNA酶学操作提供了底物。

重组DNA定向改造基因组结构或生产重组DNA产物

重组DNA技术(recombinant DNA)的目的是将不同的DNA片段(如某个基因或基因的一部分),按照人们的设计定向连接起来,在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达,产生影响受体细胞的新的遗传性状。前面所述的限制性内切酶、DNA连接酶及其他工具酶的发现和应用是这一技术得以建立的关键。

DNA技术可用于大量生产某些正常细胞代谢中产量很低的多肽,如激素、抗生素、酶及抗体等。另外,重组DNA技术可用于定向改造某些生物基因组结构。此外还被用于基础理论研究。分子生物学研究的核心是遗传信息的传递和控制,根据中心法则,研究的目的就是从DNA到RNA,再到蛋白质的全过程,即基因的表达和调控。在这里,无论是对启动子的研究,还是对转录因子的克隆分析,都离不开重组DNA技术。

修饰DNA的酶类

注:(A):限制性内切酶;(B):连接酶;(C):聚合酶

表达克隆(expression cloning)是一种用于分离可通过生物测定方法筛选编码蛋白质的cDNA策略,此策略利用转染技术,从哺乳动物细胞或酵母细胞表达cDNA,哺乳动物细胞等作为表达cDNA的工厂,用生物测定的配体结合方法或底物转换方法监测分泌蛋白、受体或酶。5α-还原酶(5αreductase)是催化睾酮转变为雄激素和二氢睾酮的重要酶。在男性,5α-还原酶起着介导男性分化和促前列腺生长等作用。Andersson等利用大鼠5α-还原酶cDNA做杂交探针筛选人前列腺cDNA文库,分离得到1个2.1kb大小cDNA片段,将之进一步克隆到表达载体上,然后转染猴cos7细胞,为测定该cDNA片段在猴cos7细胞中表达的蛋白质的生物活性,将14C标记的类固醇(如14C标记的睾酮)作为底物加入转染细胞的培养液中,随后用双氯乙醇进行有机抽提,并进行单层层析和液闪计数。在体外,该cDNA片段表达的蛋白质活性测定方法是用磷酸盐缓冲液(PBS)将转染48小时的细胞洗涤2次后,向细胞混匀液加入类固醇底物,再加入NADPH启动反应过程,双氯乙醇终止反应,用上述方法进行单层层析,最后,根据底物的转化率,确定该cDNA片段具有人体生理状况时的5α-还原酶活性。因此,通过表达克隆方法克隆得到5α-还原酶基因。1型11β-羟类固醇脱氢酶以及ACTH受体基因也是用类似的方法克隆鉴定出来的。

重组DNA技术过程

测定DNA序列确定克隆基因及其表达产物结构和功能

DNA序列测定的工作基础是在变性聚丙烯酰胺凝胶(测序胶)上进行的高分离度的电泳过程。测序胶能在长达500bp的单链寡核苷酸中分辨出1个脱氧核苷酸的差异。在操作中,相应于待测DNA区段,产生了一套标记的寡核苷酸单链,它们有固定的起点,但另一端是按模板序列连续终止于各不相同的核苷酸。确定每个脱氧核糖核苷酸的序列关键是在4个独立的酶学或化学反应中产生终止于所有不同的A、T、G、C位点的寡核苷酸链,而这4个反应的寡核苷酸产物在测序胶的相邻泳道中都能被一一分辨出来,由于4个泳道中再现了所有可能寡核苷酸链,DNA的序列可在4个寡核苷酸“阶梯”中依次直接读取。

从一套测序反应中所能获得的信息量受限于测序胶的分离度,一般获得的可靠序列信息大约在300个核苷酸。因此,如果待测的DNA的区段在300个核苷酸内,只需将之克隆至合适的载体上,即可测序。对于大片段DNA的序列测定,需要将其切割成能单独测序的小片段后再进行测序。

目前广泛应用的DNA测序方法有酶学的双脱氧法和化学裂解法,测序的策略包括定向测序、随机测序策略(又称鸟枪测序法)和多路测序策略,而未来的发展的质谱法、杂交测序法、单分子测序法和原子探针显微镜测序法的进一步应用,将为临床基因诊断和治疗提供更为快捷方便的测序方法。