HER-2的检测方法(乳腺肿瘤学 HER-2的检测及其临床意义)

1．IHC

建议使用相关机构批准的抗体（试剂盒）。为保证检测结果的可靠性，在使用前必须经过严格的实验室内部和外部质量控制程序验证和（或）对比试验，并建立完善的实验室标准操作程序（SOP）。应严格按各试剂盒的标准程序进行染色，使用非生物素检测法和高质量的DAB显色液，以避免内源性生物素的影响。在显微镜下监控显色过程，避免过显色而造成很强的背景。在染色过程中，每一步都要充分洗涤，并始终保持切片潮湿。IHC自动染色系统更易达到标准化，但应进行严格的对比试验和程序优化。每一批次的IHC染色均需设阳性和阴性对照，经FISH或CISH检测阳性的浸润性导管癌可用作阳性对照。被检测切片癌旁组织中的正常乳腺上皮细胞是很好的阴性内对照。

2．FISH

（1）HER-2探针：建议使用相关机构批准的检测试剂盒。目前进行HER-2基因状态检测的探针绝大部分是同时含有HER-2基因（标记为橘红色荧光）和该基因所在的17号染色体着丝粒（CEP17，标记为绿色荧光）的混合探针。

（2）影响检测结果的因素

1）造成实验失败，结果不能判读：①细胞核被损坏，边界不完整；②组织过度消化，细胞核边界不完整，二脒基苯基吲哚（DAPI）染色浅；③组织消化不足，无信号。

2）不能计数分析细胞：①细胞核被切割得不完整，直径明显小于其他细胞；②细胞核重叠；③缺乏绿色或橘红色信号。

一旦发现染色结果未达到要求，则不能判读，必须重新制片和染色。

（3）对照

1）内对照：使用上述同时含有HER-2基因和CEP17的混合探针。杂交后的组织细胞中有≥75%的细胞核显示出双色信号时视为检测成功，并且橘红色、绿色信号互为对照，癌细胞与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为FISH检测失败：①对照标本未出现预期结果；②可计数信号10%的荧光信号存在于胞质内；④细胞核结构难以分辨；⑤有强自发荧光。

2）外对照：应选择FISH阳性和阴性的切片（或采用厂家提供的对照片）作为外对照。

3．CISH

（1）HER-2探针：建议使用相关机构批准的试剂盒。使用地高辛标记的探针，在4%中性缓冲甲醛固定、石蜡包埋组织切片上进行杂交反应，再用鼠抗地高辛抗体和辣根过氧化物酶抗鼠抗体进行免疫结合，DAB显色。

（2）影响检测结果的因素：①加热预处理的温度和时间；②消化时间的长短；③加热共变性时杂交液的蒸发；④杂交后洗涤是否干净；⑤苏木精对比染色的着色深浅。

（3）注意事项：①加热预处理的温度保证在98°C以上，最好完全煮沸，时间15分钟；②具体消化时间因组织的固定时间、固定方式和切片的厚度而异，建议消化时间5～30分钟；③杂交液滴加后必须覆盖杂交膜，再用封片胶密封；④杂交后的洗涤温度最低应在75°C以上，最高不超过80°C；⑤苏木精对比染色着色不可过深，否则会遮盖杂交信号。其中，最为关键和困难的是消化时间的掌握，消化不足会影响杂交效果，消化过度会破坏组织形态。

（4）对照：每次染色必须设立严格的阴性、阳性对照（试剂盒中有阴性、阳性对照片），被检测切片癌旁组织中的正常乳腺上皮细胞、间质细胞、淋巴细胞可作为阴性对照。