乳腺干细胞、乳腺癌干细胞的鉴定与分离(乳腺肿瘤学 干细胞与乳腺癌)

乳腺干细胞的鉴定与分离

DeOme等于1959年利用小鼠乳腺分离出的上皮细胞，经有限稀释培养获得细胞克隆。再将获得的细胞克隆种植在已清除了腺组织受体的小鼠乳腺脂肪垫，一段时间后形成了含导管、腺泡和肌上皮的乳腺组织，借此探讨乳腺组织中是否存在干细胞这一问题。1971年，Daniel等移植小片的乳腺上皮组织于小鼠体内，可以发育为完整的乳腺结构，从而提出乳腺干细胞存在的可能。此后，1998年Smith等的移植实验发现，在小鼠乳腺组织（不受部位、年龄和所处发育阶段的限制）中可以分离出具有完全发育能力的细胞，这种具有发育能力的单个细胞经几代移植后可再生为功能完整的乳腺腺体。上述实验有力地证明，成熟的分化完全的小鼠乳腺中存在具有分化潜能和自我更新能力的乳腺干细胞。

目前有多种手段可以识别乳腺干细胞，包括侧群（side population，SP）细胞分离、干细胞抗原-1（Sca-1）等免疫组化表型标记、超微分析、DNA标记、激素受体表达等。其中，Sca-1和SP是识别乳腺干细胞常用的2个标记。

Sca-1，也称Ly-6a，是一种磷脂酰肌醇锚定膜蛋白，为Ly-6家族成员之一。大约20%的乳腺上皮细胞和75%的SP细胞表达Sca-1。Sca-1可能是乳腺干细胞的一个表面标记。Welm等研究表明，小鼠乳腺中也存在Sca-1阳性细胞。标记实验显示，在分裂缓慢的静息细胞群中Sca-1含量丰富。在有限稀释重建实验中，1 000个富含Sca-1的小鼠原代培养细胞接种到清空乳腺组织的宿主小鼠乳腺脂肪垫，可重建乳腺，而丢失Sca-1表型的原代培养细胞移植后缺乏乳腺生长活性。上述结果表明，Sca-1可能是乳腺干细胞的一个表面标记，可以利用其分离小鼠功能性乳腺干细胞。但是，应用Sca-1单个标记做流式细胞分选（FACS）分析，分离与移植Sca-1阳性细胞对于特异细胞分离有高度依赖性。

SP细胞是指具有排出DNA结合染料Hoechst-33342能力的细胞。Hoechst-33342的排出作为一种独特的方法用于从骨髓、心、肺、肌肉、眼、胰腺等多种组织中识别可能的干细胞。SP细胞最早用于鉴定造血细胞，250个SP细胞即可重建经致死量照射的小鼠造血系统。2002年，Christian等从骨髓细胞的分析中发现SP表型有赖于乳腺癌耐药蛋白（ABCG2/BCRP-1）的存在。许多人类癌细胞系都存在BCRP。BCRP是一种多药转运剂，可将其看成一种排出毒物的泵。SP细胞由于表达BCRP-1，可以排出Hoechst-33342染料。用维拉帕米处理SP细胞，由于抑制BCRP-1的表达，SP表型消失。骨髓SP细胞具有造血干细胞特征性表面标记Sca-1+/Lin-/low。在小鼠和人类的乳腺上皮中也存在SP细胞。2002年，Welm等首次证实小鼠乳腺上皮细胞群中有2%～3%的SP细胞，其中75%的SP细胞Sca-1阳性。2003年，Alvi等从人类和小鼠的正常乳腺上皮细胞中分离出SP细胞，且采用有限稀释移植实验证明，将2 000～5 000个小鼠乳腺SP细胞移植入清除腺体的小鼠乳房脂肪垫，可进一步分化形成乳腺组织。但并非所有的SP细胞均为干细胞，乳腺上皮细胞的SP细胞群中干细胞仅占SP细胞的1/10～1/5。SP细胞应包括干细胞、祖细胞及因某种原因而表达BCRP的细胞。

乳腺癌干细胞的鉴定与分离

乳腺癌组织中也存在少数可以自我更新、具有致瘤性的肿瘤干细胞，即乳腺癌干细胞。2003年，Al-Hajj等借助乳腺癌细胞移植动物模型，第一次在实体瘤中鉴定了肿瘤干细胞，证实了乳腺癌干细胞的存在，这为实体瘤中存在肿瘤干细胞提供了最直接的证据。肿瘤干细胞具有类似于成体干细胞的增殖特征，具有强大的增殖潜能，但增殖速度很缓慢，多数细胞处于细胞周期的G0/G1期，并表达大量的耐药基因，所以对化疗、放疗和内分泌治疗等治疗手段均不敏感，使得常规的癌症治疗方法并不能特异性针对肿瘤干细胞，被认为是许多癌症发生发展的真正原因。它们的存在解释了为什么肿瘤在治疗后会发生复发和转移。此外，只有发生转移的癌细胞内具有一定数量的肿瘤干细胞，才能形成转移灶，表现为临床转移。可见，消灭肿瘤干细胞是治疗肿瘤、预防复发和转移的关键，这使得肿瘤干细胞的研究成为一大热点。

肿瘤干细胞的分离、分选、鉴定、培养和扩增是研究肿瘤干细胞的生物学特性以及作用机制的前提。然而，实体瘤肿瘤干细胞的纯化是相当困难的。一方面是因为肿瘤中肿瘤干细胞的含量极少；另一方面是因为目前已明确的肿瘤干细胞表面标记也不多。因此，肿瘤干细胞的鉴定和纯化是限制肿瘤干细胞研究发展的瓶颈。

FACS

利用乳腺癌干细胞表面特异性表达膜蛋白，如CD44、CD24等的特点，采用其中一种或两种以上不同波长的荧光素标记的单克隆抗体标记单细胞悬液后，实现FACS分选。如急性白血病干细胞，以及脑膜瘤、前列腺癌、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、结肠癌等肿瘤干细胞的研究均采用此种方法。

Al-Hajj等从1例原发性乳腺癌和8例乳腺癌转移性胸腔渗出物取样，利用流式细胞仪筛选细胞表面标记并分离和鉴定出乳腺癌干细胞（占总肿瘤细胞数2%）。实验结果显示，少至100个CD44+/CD24-/lowLin-肿瘤细胞移植入NOD/SCID小鼠体内，12周内发生肉眼可见的肿瘤。但是，将成千上万个其他表型的肿瘤细胞移植入NOD/SCID小鼠体内也不发生肿瘤。CD44+/CD24-/lowLin-肿瘤细胞仅少量就能发生肿瘤的能力，使人们联想到正常干细胞的器官生成能力。那么，CD44+/CD24-/lowLin-肿瘤细胞移植传代过程中是否呈现类似正常乳腺干细胞自我更新和分化的特性呢？Al-Hajj等对这一问题也进行了描述。结果表明，新发生的肿瘤具备所有上一代肿瘤的组织病理学特征，且仍含有1%～5%的CD44+/CD24-肿瘤细胞，从而很好地证明了CD44+/CD24-/lowLin-肿瘤细胞自我更新和分化的特性。自此以后，CD44+/CD24-作为乳腺癌干细胞的表面标记被广泛接受。Abraham等的研究表明，在乳腺癌中高表达CD44+/CD24-的肿瘤细胞与乳腺癌的远处转移有着密切的关系。

除了CD44+/CD24-等表面标记外，表达于胞质的乙醛脱氢酶-1（aldehyde dehydrogenase-1，ALDH-1）同形物也可以作为分离和鉴定乳腺癌干细胞的标记。Ginestier等研究表明，ALDH-1高活性的乳腺癌细胞群具有自我更新、多向分化潜能、致瘤性等特性，提示ALDH-1的表达也可作为乳腺癌干细胞的表面标记之一。相对于CD44+/CD24-肿瘤细胞，更少的ALDH-1+细胞移植入NOD/SCID小鼠体内就可发生肿瘤。ALDH-1是一种可氧化细胞内醛的具有解毒功能的酶，目前可通过FACS分析荧光标记的乙醛脱氢酶底物来检测细胞的ALDH-1活性。最近（2009年）的研究表明，ALDH-1较CD44、CD24而言是一种能更有效地预测耐药和远处转移的表面标记。

此外，已有研究证实CD133作为表面标记可以分离出一组与CD44+/CD24-肿瘤细胞不重叠的乳腺癌干细胞。在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中，可以PROCR和ESA代替CD44+/CD24-/low和ALDH-1，富集具有自我更新等分裂能力的乳腺癌干细胞。

另一种FACS的方法是利用乳腺癌干细胞的耐药性。乳腺癌干细胞高表达耐药基因ABCG2/BCRP-1，ABCG2/BCRP-1基因在多种来源的干细胞膜表面都有表达，而在大多数成熟细胞中不表达。BCRP是一种多药转运剂，可将其看成一种排出毒物的泵。乳腺癌干细胞由于表达BCRP-1，可以高效排出Hoechst-33342染料。Patrawala等利用肿瘤干细胞的这种特性，使用FACS系统特异性分离出肿瘤干细胞。在FACS的散点图中，这些少量的染色阴性的肿瘤干细胞处于大多数细胞的一侧，故称为SP细胞。SP细胞比非SP细胞具有更高的成瘤性。SP细胞生成的肿瘤中不仅含有SP细胞，还含有非SP细胞。目前，多数学者认为SP细胞中富集肿瘤干细胞。

免疫磁珠细胞分选

免疫磁珠细胞分选（MACS）是利用未标记的单克隆抗体作为第一抗体，与单细胞悬液孵育后再用免疫磁珠标记第二抗体。这种标记的细胞悬液流过特制的磁场时，可吸附在磁式分选柱内，再将磁式分选柱从磁场内移开，从柱内洗脱、收集肿瘤干细胞。

球囊培养

在去血清的培养基中，具有自我更新能力的乳腺癌细胞可以培养形成乳腺癌球囊。近年来，Ponti等和Cariati等利用乳腺球悬浮培养法成功富集乳腺癌干细胞。

乳腺球悬浮培养是利用乳腺癌细胞在体外培养时可以形成乳腺球的特性，分离并纯化乳腺癌干细胞，是鉴定肿瘤干细胞自我更新能力的有效方法之一。其原理为：肿瘤细胞在添加了生长因子的特定培养基中生长，其中的肿瘤干细胞因增殖而形成致密球状，保持不分化状态；而非肿瘤干细胞则贴壁生长，且生长速度缓慢。在DMEM/F12悬浮培养体系中，分化后的细胞将逐渐凋亡，未分化的细胞则出现不对称性分裂，不断自我更新并维持未分化状态，最终形成由单克隆起源的干细胞和祖细胞构成的细胞集落。2011年，Guttilla等研究证明MCF-7乳腺球经过5代传代培养后，干细胞的比例从贴壁细胞中的0.2%上升到92.2%。这为乳腺癌干细胞的富集提供了又一重要手段。

如前所述，实体恶性肿瘤被视为人体内一个异常的器官，其内含有瘤体演化过程中各种分化层次的癌细胞，包括具有强大增殖能力、能维持肿瘤生长和发展的肿瘤干细胞，增殖分裂迅速的前体细胞和处于分化终末期的成熟癌细胞。在许多肿瘤组织中，分裂缓慢的肿瘤干细胞通过复杂的机制产生前体细胞。尽管上述3种方法已被广泛接受并应用于肿瘤干细胞的鉴别和分离，但是这些方法纯化的不仅仅是肿瘤干细胞，还含有部分前体细胞。

为了更精准地纯化乳腺癌干细胞，为乳腺癌干细胞的研究提供更好的模型，笔者课题组试图寻找富集纯化乳腺癌干细胞的新策略。上文已经提到肿瘤干细胞处于细胞周期的G0/G1期，并表达大量的耐药基因，对多种化疗药物不敏感，提示能否通过化疗处理，使化疗敏感的癌细胞被杀灭，而化疗不敏感的肿瘤干细胞则被富集筛选出来。临床上乳腺癌新辅助化疗的治疗模式为初步探讨这个问题提供了机会。笔者发现接受新辅助化疗的乳腺癌患者，化疗后的肿瘤组织标本中含有较多的乳腺癌干细胞，也就是说体内化疗压力可以富集乳腺癌干细胞。利用肿瘤干细胞对常规化疗耐药的特点，将SKBR3种植于免疫缺陷NOD/SCID鼠的乳腺脂肪垫，形成乳腺癌肿瘤异种移植模型，同时给予低剂量化疗压力，将形成的移植瘤细胞再次移植到NOD/SCID鼠，并给予化疗。如此反复3代，筛选出富含化疗耐药的乳腺癌干细胞的细胞株模型，命名为SK-3rd。这为乳腺癌干细胞研究提供了极好的模型。SK-3rd具有包括球囊形成率增强、自我更新能力、多向分化潜能、耐药性等在内的一切肿瘤干细胞的特性。此外，从异种移植瘤中新鲜分离的SK-3rd细胞中CD44+/CD24-/low的细胞约为72%。据评估，SK-3rd细胞系中肿瘤干细胞的含量约为16%。SK-3rd体内成瘤能力、转移能力及球囊形成率明显高于SKBR-3。

此外，还有一些新的途径可产生乳腺癌干细胞。上皮-间质转化（EMT）在肿瘤的侵袭和转移中发挥着至关重要的作用。最近研究表明，EMT可以促进乳腺上皮干细胞和乳腺癌干细胞产生，这为肿瘤干细胞的富集和纯化提供了又一新的策略。