遗传病的诊断(皮肤病学 皮肤遗传学)

基因诊断是指以DNA或RNA为诊断材料，通过检测基因的存在、缺陷或表达异常，对人体状态和疾病作出诊断的方法和过程。基因诊断可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者作出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。

基因诊断策略

疾病的发生不仅与基因结构的变异有关，而且与其表达功能异常有关。基因诊断的基本原理就是检测相关基因的结构及其表达是否正常。由于DNA的突变、缺失、插入、倒位和基因融合等均可造成相关基因结构变异，因此，可以直接检测上述变异并进行分析，如致病基因位置，也可利用与致病基因紧密连锁的遗传标记（如短串联重复STR）方法来进行基因诊断，这均为DNA诊断。还可对基因表达产物mRNA质和量的变化进行分析，此为RNA诊断（RNA diagnosis）。

基因诊断的方法

基因诊断是以核酸分子杂交（nucleic acid molecular hybridization）和聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）为核心发展起来的多种方法，同时配合DNA序列分析。近年新兴的基因芯片可能会发展成为一种很有用的基因诊断方法。

DNA诊断：常用检测致病基因结构异常的方法有下列几种。

1. 斑点杂交（或叫Southern杂交）：根据待测DNA样本与标记的DNA探针杂交的图谱，可以判断目标基因或相关的DNA片段是否存在，根据杂交点的强度可以了解待测基因的数量。
2. 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）法：PCR的应用和发展，使基因分析和基因工程取得了突破性进展。应用PCR技术可以使目的基因或片段在短时间内得到大量扩增，从而使进一步的分析成为可能。通过设计突变位点特异性引物，突变基因可得到扩增并被检测到，无突变基因则不会扩增，从而将突变基因与正常基因分开，这种方法又叫等位基因特异扩增（allele-specific amplification，ASA）。
3. 等位基因特异的寡核苷酸探针（allele-specific oligonucleotide probe，ASO probe）杂交：根据点突变位点上下游核苷酸序列，需人工合成两条长约20个核苷酸的片段，一条为突变基因片段，另一条为相应位置的正常基因片段，突变的碱基位于核菅酸片段中央，经核素或非核素标记后可作为探针，在严格杂交条件下，只有完全匹配的DNA才出现杂交点，即使只有一个碱基不配对，也不可能形成杂交点。这样就可以把突变基因与正常基因区分开来。若与PCR方法联合应用，即PCR/ASO探针杂交法（PCR/ASO probe hybridization），是一种检测基因点突变的简便方法，先用PCR方法扩增突变点上下游的序列，扩增产物再与ASO探针杂交，可明确诊断突变的纯合子和杂合子。
4. 单链构象多态性（single strand conformation polymorphism，SSCP）：其基本原理是依据单链DNA在某一种非变性环境中具有其特定的构象。DNA序列甚至单碱基变化都能导致这种空间构象的改变，在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中，构象不同导致电泳迁移率不同，从而将正常链与突变链分离出来。但是PCR-SSCP技术的突变率只有50%-80%，而且SSCP的最适检测长度约为100-300bp，该方法不能确定突变的性质，还需要DNA测序来确认。在SSCP技术的基础上发展起来的RNA单链构象多态性检测（PCR-rSS-CP）、双脱氧测序单链片段构象多态性分析（PCR-ddF）和限制性内切酶指纹技术（PCR-REF），其检测效率更高。
5. 限制性片段长度多态（restriction fragment length polymorphism，RFLP）分析：遗传连锁分析人群中个体间DNA的序列存在差异，据估计每100-200个核苷酸中便有1个发生突变，这种现象称为DNA多态性。有些DNA多态性可改变某一限制性内切酶的识别位点，因而产生了DNA限制性片段长度多态性。RFLP按盂德尔方式遗传，在某一特定的家庭中，如果某一致病基因与特定的多态性片段连锁，可以遗传给子代，因此这一多态性片段可作为遗传标记，来判断该家庭成员或胎儿的基因组中是否携带该致病基因。
6. 熔解曲线分析：当目的基因发生变异时，其碱基组成也会发生变化，导致熔解温度（Tm）改变而形成特异的熔解曲线，对PCR产物进行熔解曲线分析，可以鉴别突变基因与正常基因。扩增时常掺人荧光染料或特异性荧光标记探针，常用的染料SYBY Green I是一种双链特异性的DNA染料，只与双链DNA结合，并且单个存在时并不发射荧光，只有当多个SYBY Green I嵌入双链时才能被检测到。荧光共振能量转移（fluorescence resonance energy transfer，FRET）结合探针是通过对杂交产物稳定性进行实时监测来得到特征性的探针熔解曲线，通过曲线分析即可检出产物中是否存在突变。
7. 异质双链（heteroduplex，HTX）分析：在固体支持物上电泳时，异质双链（HTX）DNA构象的变化决定了其电泳迁移率不同于纯合双链（homoduplexes）。基于这一原理的HTX分析，主要是把野生型和突变型双链扩增产物同时变性并混合变性，通过EB染色最终显示的电泳条带，分析相应序列结构的构象所决定的迁移位置变化，进而判断突变的有无。错配裂解法（dismate cleavage，DC）和变性高效液相色谱分析（DHPLC）也可用于对异质双链的分析。错配裂解法分为酶错配裂解法（enzyme mate cleavage，EMC）和错配化学切割法（chemical cleavage mate，CCM）。两种方法的基本原理是利用内切酶或化学试剂对异质双链中的错配碱基进行切割，然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测突变。DHPLC检测时，PCR产物在变性条件下，泳动于55℃的吸收剂中，依靠双链碱基组成的构象差异，只需泳动5分钟，突变的有无最终表现为洗脱峰形的差异。DHPLC通过自动化程序式操作即可完成对外显子大小片段的全部检测，该技术的最大优点是高效、简便、省时、无放射性污染。
8. 变性梯度凝胶电泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）：DGGE技术利用由碱基序列所决定的DNA片段熔解温度（或称变性度）的差异，这种差异导致了电泳分离中泳动率的变异，从而达到分离野生型和突变型片段的目的。该技术可以达到单碱基的分辨率。DGGE适合检测500~1000 bp的DNA片段。此外，与固定变性剂凝胶电泳（constand denaturant gel eleouophorsis，CEGE）联合作用，使得DGGE技术发展更趋完善。
9. 引物单碱基延伸法：是指将引物3’端、发计在变异位点上游一个碱基处，PCR反应体系中用双脱氧的ddNTP代替dNTP，从而使引物只能延伸一个碱基，使用DNA测序仪并结合相应软件来分析变异碱基。可以在引物的5’端加上不同长度的多聚寡核苷酸来实现多个位点的同时分析。
10. 短串联重复（short tandem repeat，STR）多态性分析：STR的重复单元较短，核心序列含2-4 bp，DNA片段长度为100-500 bp，又叫微卫星DNA（microsatellite DNA）。微卫星DNA有较高的多态性，是一种应用价值很高的遗传标记。微卫星DNA长度较短，适合PCR操作。STR可与致病基因紧密连锁，同时某些遗传病就是由STR所导致，所以STR也可用于基因诊断。
11. 基因芯片技术：指将大量探针分子固定在支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度进而获取样品分子的数量和序列信息。它是基于特异性探针与目的DNA杂交的原理发展起来的一种分析方法，可用于大规模检测基因突变、基因多态、基因表达水平以及测定DNA序列。该方法检测信息高通量，且自动化程度高，一次性检测可检出多个位点突变，具有很大的发展潜力。
12. DNA序列分析：对致病有关的DNA片段进行序列测定，是诊断基因异常（已知和未知）最直接和准确的方法。
13. 其他方法：如TaqMan MGB探针法，在PCR反应体系中加入两条同时标记有荧光基团和淬灭基团的特异性探针，PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报道荧光基团和淬灭基团分离，从而产生荧光信号，通过软件处理来鉴别变异碱基。罗氏公司的探针检测原理与此不同，所用两条探针分别携带荧光基团和淬灭基团，探针不会被酶切降解，荧光信号与探针跟模板间的变性与复性有关。

RNA诊断：RNA诊断主要是分析基因的表达功能，检测转录物的质和量，以判断基因转录效率的高低，以及转录物的大小。

1. RNA印迹（Northern blot）：RNA印迹是检测基因是否表达，表达产物mRNA的大小的可靠方法，根据杂交条带的强度，可以判断基因表达的效率。
2. RT-PCR：是一种检测基因表达产物mRNA的灵敏方法，若与荧光定量PCR结合可对RT-PCR的产物量进行准确测定。表达谱芯片可以对基因表达进行高通量分析。

遗传病基因诊断的伦理学问题

人类基因组计划（human genome project，HGP）为推动医学进步带来了空前的机遇，疾病基因诊断有可能发展成医学的重要分支并实现产业化。产前基因筛查有助于识别出疾病基因或风险基因的携带者，这固然为疾病的早期预防提供了便利，但同时也可能带来一系列伦理、法律和社会学问题。

与一般疾病不同，遗传病的基因信息有很大一部分属于隐私领域，患者更加要求自主性，更加要求知情同意和保密。在我国目前医学遗传学临床应用低水平以及尚未体系化的情况下，有许多问题仍有待解决。如：医生或遗传病患者是选择只将较严重的遗传病信息告知亲属，还是只将较轻微的遗传病信息告知亲属；中国的遗传咨询目前在许多地方已经开展，遗传咨询的医生如何在尊重个人和家庭隐私的前提下，给予求咨者和家庭充分的必要的信息；如何保护求咨者的隐私不受雇主、保险公司、学校不正当的侵犯；在我国公民的知识水平基础上如何保证遗传咨询的非指令性指导等等。

为降低我国人口的出生缺陷率，1999年国家计生委已启动“出生缺陷干预工程”，主要通过遗传筛查，降低我国唐氏综合征、先天性神经管缺损、先天性甲状腺功能低下（克汀病）、苯丙酮尿症、地中海贫血、G6PD缺乏症等疾病的发病率或致残致死率，充分保障母婴安全和提高我国人口素质。

尽管遗传病基因诊断涉及的伦理、法律和社会问题广泛而深刻，只要充分地认识到这些问题的存在，注意宣传和知识普及，形成社会共识，参照国际准则和国际经验并结合我国实际，制订可操作的、有行为规范作用的条例与法规，与此相关的伦理、法律、社会问题是可以逐步得到妥善解决的。