纤溶酶原活化物：内源性（生理性）及外源性活化物(血液病学 纤维蛋白溶解机制)

组织型纤溶酶原活化物（tissue plasminogen activator，tPA）

蛋白结构和基因结构

tPA属丝氨酸蛋白酶，是一种糖蛋白，含7%～13%的糖类，分子量约为70kDa。天然tPA为527或530个氨基酸组成的单链分子，由cDNA已推测出完整的氨基酸序列。

纤溶酶在精氨酸²⁷⁵-异亮氨酸²⁷⁶处裂解单链tPA，将其转变为双链形式（A链和B链），但两条链之间仍有一条二硫键相连。A链含4个结构域：指状结构域、表皮生长因子（EGF）结构域和两个环状结构域。指状结构域和第2环状结构域是tPA与纤维蛋白结合的部位。EGF结构域可能是tPA与细胞表面受体结合的部位。第1环状结构域有何特殊功能尚未确定，也可能具有与纤维蛋白结合的能力。B链为蛋白酶区，含tPA酶活性部位。与其他丝氨酸蛋白酶相似，其活性部位也由组氨酸、天冬氨酸和丝氨酸3种氨基酸组成。

tPA基因位于8号染色体（8p12- q11. 2），其长度大于36kb。它邻近骨髓增生性疾病中所见到的一种转位裂点，而且在真性红细胞增多症和骨髓纤维化患者中已观察到tPA表达增多。tPA基因有14个外显子和12个内含子，基因结构以及内含子与外显子的衔接方式与uPA极为相似。但tPA和uPA两者之间的cDNA和氨基酸序列仅有40%的同源性。完整的tPA的cDNA由2530bp组成。

合成及其调节

生理情况下tPA主要由内皮细胞合成并贮存。大多数血管的内皮细胞可分泌tPA，但不同部位的血管分泌tPA的量明显不同，如上肢释放tPA的量比下肢高约4倍。此外，间皮细胞和许多造血细胞如巨核细胞、单核细胞也分泌tPA。从其他许多组织（子宫、肺、前列腺、卵巢、甲状腺等）及恶性细胞株中也分离出了tPA。肝脏和肾脏不分泌tPA。tPA广泛分布的特征不仅可解释其清除血管中纤维蛋白的作用，也可解释其在组织修复、肿瘤转移、巨噬细胞功能等方面的作用。

许多生理和环境因素可影响tPA的合成与释放。

tPA抗原的分泌具有生理性昼夜节奏，早晨最高，日间渐降。但游离tPA水平（与活性相关）早晨最低，日间渐升，午后达高峰。游离tPA水平的生理节奏与PAI- 1水平的波动有关。PAI- 1水平早晨最高，但日间下降的比tPA多，因而造成午后较高浓度的游离tPA。

总的来说，老人的tPA抗原水平较高，但游离tPA浓度非但不增加反而减少。与女性相比，男性的tPA抗原水平较高，游离tPA水平较低（因PAI- 1活性较高）。

体育锻炼可使循环中游离tPA升高，升高的程度与体育锻炼的强度有关，马拉松比赛后tPA甚至可高达正常水平的30倍。静脉淤滞可使tPA释放增加。下肢静脉淤滞引起的tPA增加要比上肢低得多。

凝血酶可致内皮细胞大量释放tPA。凝血接触性激活时产生的缓激肽可引起血管扩张和剂量依赖性的tPA释放。内皮素（endothelin）是由内皮细胞产生的一种极强的血管扩张物，动物实验已证实内皮素- 1和内皮素- 3可致tPA释放。动物实验表明血小板活化因子可引起tPA释放。此释放作用受细胞色素P-450单氧化酶抑制物和花生四烯酸的抑制，而不受环氧化酶抑制物的抑制，这提示血小板活化因子所致的tPA释放可能与磷脂酶途径中的环氧化酶产物有关。成纤维细胞生长因子（bFGF）可介导快速钙离子内流，增加tPA活性。静脉输注血管加压素可产生缓慢而明显的tPA释放，故有人推测血管加压素可能参与游离tPA的生理调节。在人体内，输注DDAVP或肾上腺素可使内皮细胞快速释放tPA。静脉输注前列环素（PGI₂）可一过性缩短优球蛋白溶解时间。PGI₂的稳定代谢产物，如PGE₂、PGD₂、PGF_2α、6-酮PGE₁，均可引起tPA的释放。

在内毒素刺激下，单核细胞释放的肿瘤坏死因子（TNF）下调tPA的表达和增加PAI- 1和PAI- 2的合成，减弱纤溶活性。

吸烟可触发tPA的释放，但长期吸烟者的tPA 和PAI- 1抗原的基础水平较高，而tPA的活性水平较低。

血浆浓度和血浆形式

在人血浆中，tPA主要以与其主要抑制物PAI- 1形成复合物的形式存在。游离tPA浓度仅为1μg/L（约合0. 5U/ml），而tPA抗原水平为5μg/L。换言之，健康人在静息状态下，血浆中仅20%以下的tPA为游离形式。tPA的血浆半衰期仅为5～6分钟。循环中的tPA受α₂-AP、α₁抗胰蛋白酶和C₁抑制剂的缓慢抑制，主要由肝脏快速清除。

功能及其调节

tPA是血液中主要的内源性纤溶酶原活化物，能催化纤溶酶原的活化。

tPA的蛋白水解活性位于B链，tPA裂解精氨酸⁵⁶¹～缬氨酸⁵⁶²肽键，使单链的纤溶酶原活化为纤溶酶。

初分泌的单链tPA已具有激活纤溶酶原的活性，这与纤溶系统的其他成分有所不同，表明tPA并非以无活性的酶原形式生成。tPA在无纤维蛋白时激活纤溶酶原的作用极弱，这主要是由于在无纤维蛋白存在时，tPA对纤溶酶原的亲和性低。tPA的活化有赖于tPA和纤溶酶原吸附于纤维蛋白形成三联复合物。此时，tPA的构象发生改变，对纤溶酶原的亲和力大大增加，催化纤溶酶原的酶活性增加约1000倍。单链tPA在无纤维蛋白时虽可激活纤溶酶原，但活性低于双链tPA。在有纤维蛋白时此差异消失，这可能是由于与纤维蛋白结合后单链tPA的构象发生改变，更易与纤溶酶原结合，也可能是由于构象变得与双链tPA相似。tPA以非酶原的单链形式分泌以及与纤维蛋白结合后酶活性增加可能有利于确保纤维蛋白生成时纤溶的即刻启动和将纤溶限制于血块形成处并增强局部的纤溶强度。

tPA与纤维蛋白的亲和性与指状结构域和环状结构域有关。tPA指状结构域与纤维连接蛋白中的纤维蛋白结合区的结构相似，能与纤维蛋白结合，但赖氨酸类似物对此结合部位无竞争性。tPA第2环状结构域与纤溶酶原第4环状结构域具有相似的结构，能与带正电荷的赖氨酸残基和6-氨基己酸结合。

tPA主要受PAI- 1的抑制。丝氨酸蛋白酶与其相应的“丝氨酸蛋白酶抑制物”（serine protease inhibitor，“serpin”）的反应一般分为两步，首先丝氨酸蛋白酶与抑制物可逆性结合，继之，丝氨酸蛋白酶的活性部位与抑制物的反应部位相互作用。tPA与PAI- 1的相互作用也符合此原则。

单链或双链tPA均能与PAI- 1反应。tPA分子上有3个非活性部位可与PAI- 1起反应：指状结构域、第2环状结构域以及位于B链N端的一段肽段（氨基酸残基296～304）。后者邻近tPA的活性部位，可能通过其所含的4个带正电荷的氨基酸与PAI- 1上含3个负电荷的一段互补序列起反应，使tPA上的精氨酸³⁰⁴与PAI- 1上的谷氨酸³⁵⁰形成盐桥。研究表明在单链tPA转变为双链形式时，指状结构域上的PAI- 1结合部位被遮蔽起来，而暴露出位于第2环状结构域上的另一个PAI- 1结合部位。由于实验表明含tPA第2环状结构域内环（序列248～255）的肽段可抑制tPA与PAI- 1复合物的形成，但不影响tPA与纤维蛋白的结合，提示tPA第2环状结构域上的PAI- 1结合部位不是结合纤维蛋白的赖氨酸结合部位。

tPA与各种细胞上的受体结合对于纤溶的调节具有重要意义。

内皮细胞上有两类tPA受体，一类为抑制性受体，可能是结合到内皮细胞表面的PAI- 1。由于tPA需通过自身的活性部位与之结合，故结合后的tPA被灭活。另一类为保护性受体，可能是一种40kD的膜联蛋白（annexinⅡ），tPA与之结合后可免受PAI- 1的抑制。

肝脏内皮细胞上有一种甘露糖受体，可识别tPA分子上富含甘露糖的第1环状结构域，肝细胞上含有一种依赖钙离子的受体，可与tPA指状结构域和表皮生长因子结构域作用，均有助于肝脏快速清除tPA。肝细胞还含有一种摄取和降解tPA- PAI-1复合物的高亲和性受体，称为低密度脂蛋白受体相关蛋白（low- density lipoprotein receptor- related protein），等同于α₂-巨球蛋白受体。该受体也可摄取和降解游离的tPA，但亲和力较低。

尿激酶型纤溶酶原活化物（urinary- type plasminogen activator，uPA）

蛋白结构和基因结构

血浆中的单链uPA为糖基化的丝氨酸蛋白酶，由411个氨基酸组成，含7%的糖类。分子量约54kDa。uPA的结构与tPA相似，但只有一个环状结构域，无指状结构域。N端含一个表皮生长因子（EGF）结构域和一个环状结构域，但与tPA不同的是，其环状结构域并未表现出对纤维蛋白或类似物的高亲和性。uPA的蛋白酶活性位于蛋白的C端部分，催化三联体由天冬氨酸²⁵⁵、组氨酸²⁰⁴和丝氨酸³⁵⁶组成。由于uPA含有数个蛋白酶裂解位点，故有几种分子形式。纤溶酶、激肽释放酶等通过裂解赖氨酸¹⁵⁸-异亮氨酸¹⁵⁹键可将单链uPA（sc- uPA）转变为双链uPA（tc- uPA），又称高分子量尿激酶（HMW-尿激酶）。纤溶酶还可裂解赖氨酸¹³⁵-赖氨酸¹³⁶键形成分子量约33kDa的tuPA，又称低分子量尿激酶（LMW-尿激酶）。凝血酶可特异性裂解sc- uPA的精氨酸¹⁵⁶-苯丙氨酸¹⁵⁷键，所形成的分子不为纤溶酶所激活，但仍保留少许溶栓活性。人的尿液中含一种酶，可于苯丙氨酸¹⁵⁷-赖氨酸¹⁵⁸键处裂解sc- uPA。

人uPA基因位于10号染色体，长6. 4kb，有11个外显子。cDNA长2. 4kb。如前所述，uPA的基因结构与tPA极为相似。但uPA完全缺失tPA基因中的第3、8和9外显子，部分缺失tPA基因中的第4外显子，故没有指状结构域和第2环状结构域。uPA的第2外显子负责编码一条20个氨基酸长的信号肽，第3和第4外显子编码生长因子结构域，第5和第6外显子编码环状结构域。第7外显子的5’区负责编码连接轻链和重链的多肽，第7外显子的3’区和第8到第11外显子则编码重链。

合成及其调节

在小鼠体内通过原位杂交已证实uPA主要产生于胃肠道的成纤维细胞样细胞、肾小管上皮细胞、输精管和附睾。在内皮细胞、肺、胰腺、肝脏、肾上腺、垂体和中枢神经系统等未发现杂交信号，但有些组织的体外提取液中含uPA。在人体内合成uPA的组织是否与小鼠相同尚不清楚。有人报道，体外培养的内皮细胞可生成uPA，但这似乎并无生物学意义。还有人报道，在炎性细胞因子的刺激下活化的内皮细胞能表达uPA。单核细胞也表达uPA，而且当给以GM- CSF时，uPA的生成增加。血小板也含uPA，但还未确定其是否为巨核细胞产生。

在人体中，uPA的水平较稳定。其血浆抗原水平未发现明显的昼夜波动，无性别差异，老年人的数值较高。静脉淤滞可明显增加uPA的抗原水平。剧烈的体育锻炼或输注DDAVP可增加循环uPA水平。一些复发性深静脉血栓的患者在输注DDAVP后则无uPA释放的增加。

血浆浓度及血浆形式

人血浆中uPA抗原浓度2～7ng/ml，相当于40～150pmol/l。血浆中主要为sc- uPA。在血浆中，tc- uPA受α₂巨球蛋白、α₁抗胰蛋白酶、抗凝血酶、α₂AP和PAI- 3缓慢抑制，受PAI- 1和PAI- 2的特异性和快速抑制，而血浆中的sc- uPA则不受上述蛋白酶的抑制。在正常人血浆中未发现uPA与PAI- 1所形成的复合物，此与tPA不同。血循环中的uPA主要通过肝脏清除，其血浆半衰期极短，约为4分钟。

功能及其调节

uPA是血液中仅次于tPA的生理性活化物。一般认为，uPA的主要功能是血管外蛋白的溶解，如促进细胞迁移（排卵及着床，肿瘤转移）和溶解尿液中的凝块，其次才是清除血管内的纤维蛋白。

初合成的sc- uPA的无酶活性或活性极低（不足tc- uPA催化活性的0. 5%）。如前所述，纤溶酶或激肽释放酶可将近乎酶原形式的sc- uPA迅速裂解为tc- uPA。tc- uPA的酶活性比sc- uPA增强约100倍。因此，普遍认为uPA在纤维蛋白降解的初期阶段基本上不起作用，待tPA使少量纤溶酶原转变为纤溶酶，后者又使sc- uPA激活为tc- uPA时才开始有效地发挥作用。虽然tc- uPA的酶活性比sc- uPA强，但tc- uPA对纤溶酶原的激活不具有纤维蛋白特异性，可致全身性纤溶酶生成，引起纤维蛋白原溶解和α₂AP的消耗。相反，sc- uPA的酶活性虽低，但由于它具有纤维蛋白特异性，实际上是一种有效的溶栓剂。这可能由于与纤维蛋白的结合防止其被血浆抑制物灭活，使得酶活性极低的sc- uPA仍能发挥特异性溶栓作用。另一种解释为：sc- uPA对于结合了纤维蛋白的纤溶酶原具有较强的亲和力，而对血浆中游离的纤溶酶原的亲和力则较弱。另外，sc- uPA不与PAI- 1和PAI- 2反应，而tc- uPA在有PAI- 1或PAI- 2存在下迅速受到抑制。

近年来，对uPA受体（uPAR）的研究取得较大进展。uPAR基因位于染色体19q13. 1～q13. 2，长23kb，有7个外显子。uPAR是一种异质性糖蛋白，50～60kD，被糖基化磷脂酰肌醇（GPI）锚定在细胞膜上，是一种特异性细胞表面受体。它由3个同源的结构域组成，其中N端的结构域与结合uPA有关，是由第2和第3外显子编码的。uPAR有两种，uPAR1和uPAR2。uPAR1由313个氨基酸组成。uPAR2是uPAR的变异型，仅含259个氨基酸，其N端的230个氨基酸序列与uPAR1相同，而C端的29个残基与uPAR1不同。uPAR2含有结合uPA的结构域，但缺乏GPI锚，因而可能是一种分泌型可溶性蛋白。uPA通过非活性部位与uPAR结合，结合后其酶活性仍保留，而且免受PAI的抑制。在生理情况下，sc- uPA与细胞表面的uPAR结合具有意义，即可加速纤溶酶的生成，生成的纤溶酶又使更多的scuPA转变为tc- uPA，从而使纤溶酶的生成进一步加速。单核细胞和内皮细胞上均有uPAR。sc- uPA与单核细胞上的受体结合后激活纤溶酶原的能力可增强20～100倍。

近年来，对依赖凝血接触系统的纤溶活化的研究也取得一些进展。在体外用高岭土激活凝血因子Ⅻ可致纤溶酶的生成，其机制可能是因子Ⅻa使前激肽释放酶转化为激肽释放酶。如前所述，激肽释放酶可使sc- uPA转变为更具活性的双链形式。纤溶活化产生的纤溶酶进一步激活因子Ⅻ，因子Ⅻa又进一步使前激肽释放酶转化为激肽释放酶，因而引起瀑布式纤溶活化。目前还未确定纤溶的接触性激活是否具有生理重要性。

外源性活化物

主要为链激酶（SK）和尿激酶（uPA）。供治疗用的尚有重组tPA等，详见有关章节。