飞秒激光介导的胶原交联术(眼科学 飞秒激光辅助的LASIK手术)
如前所述，飞秒激光是一种以脉冲形式运转的红外线激光，具有脉冲持续时间短、瞬间功率高、热效应区域小等特点，其精确聚焦和非线性吸收特性使飞秒脉冲能量被准确地传递到组织内部。由于传递过程不依赖于载色体的存在，因此可用于穿透角膜等透明组织，在角膜基质中产生微小空化气泡并膨胀融合，依靠等离子体的光裂解作用形成切削面。由于飞秒激光的整个切削过程高度精确而可控，目前已被应用于角膜屈光手术领域，并取得良好疗效。除常规的飞秒激光角膜屈光手术外，如飞秒激光辅助的准分子激光角膜磨镶术（femtosecond laser-assisted Laser in situ keratomileusis，FS-LASIK），飞秒激光还被用于其他类型的角膜屈光手术，如飞秒激光介导的胶原交联术（femtosecond laser-assisted collagen cross-linking，FS-CXL），这是一种结合了飞秒激光和胶原交联这两种技术，用于治疗角膜疾病的新的医疗手段。本节笔者将从FS-CXL的原理、临床疗效、优势和不足方面分别对其进行阐述。
胶原交联术的基本原理
胶原纤维存在于眼球的各部分组织中，在维持眼球各组织的形态和空间结构，保持眼球完整性，维持眼压，抵抗外界压力和参与屈光系统的构建方面不可或缺。到目前为止，人们已经发现了19种胶原类型。角膜是眼球中胶原含量较丰富的组织之一，其所含有的胶原主要是Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型、Ⅴ型和Ⅵ型，各型胶原的比例和分布发生改变将导致角膜生物力学的不稳定状态，是角膜膨隆性病变的主要致病因素和首要病理改变，这部分病变主要包括圆锥角膜、透明性边缘性角膜变性以及准分子激光角膜屈光术后的角膜扩张等。其中圆锥角膜最为常见，世界范围内患病率为0. 5‰～2. 3‰，我国尚未见确切的统计资料。角膜膨隆性病变的治疗包括两类，一类是光学矫正法，通过佩戴软性或硬性角膜接触镜来矫正部分或全部由于角膜不规则膨隆所造成的散光；一类是角膜形态重塑法，包括角膜基质环植入术、板层或穿透性角膜移植术、胶原交联术（collagen cross-linking，CXL）等。除角膜移植和胶原交联术之外，光学矫正和角膜基质环植入都不能从根本上解决由于角膜胶原成分和分布改变所造成的进行性膨隆状态。
胶原交联术（CXL）是指为了提高胶原纤维的张力和稳定性而采取的一种使胶原分子内部以及胶原分子之间发生共价键结合的一种方法，包括物理交联法和化学交联法。与采用戊二醛（glutaraldehyde，GTA）、甘油醛（glyceraldehyde）、京尼平（Genipin）等交联剂进行的化学交联法相比，紫外线-核黄素胶原交联术（collagen cross-linking with UVA and Riboflivin）作为物理交联法的主要方式，虽然交联程度略低，但具有减少外源性物质进入胶原以及改善胶原性能的优点，可在角膜胶原交联的同时减少对角膜透明性的干扰。紫外线-核黄素胶原交联的基本原理是利用紫外线A（UV-A）照射仪照射已由光敏剂（核黄素）浸润的角膜，在370nm波长紫外光作用下，核黄素被激发到三线态，产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），ROS诱导胶原纤维的氨基（团）之间发生化学交联反应（Ⅱ型光化学反应），从而增加了胶原纤维的机械强度和抵抗蛋白酶消化的能力。在这一技术中，核黄素的作用主要有四个：一是提高角膜对紫外线A的吸收率，可使其从32%升至95%；二是在紫外线A照射下产生ROS，诱导角膜胶原纤维间形成新的连接；三是吸收紫外线A，保护角膜内皮、晶状体及视网膜（术前角膜厚度至少为400μm）；四是在术中润滑持续暴露于空气中的角膜。
紫外线A照射仪
0. 1%核黄素溶液
紫外线A-核黄素胶原交联机制
紫外线-核黄素胶原交联技术的出现为角膜膨隆性病变的治疗带来了福音，它通过增加角膜基质胶原纤维间的共价连接从而延缓甚至阻止角膜膨隆的进展，基础和临床研究都显示这种新技术能在一定程度上加固角膜的硬度。基础研究方面，Wollensak等于2003年首次对经核黄素-紫外线A照射后的人角膜应力-应变关系进行测量，发现照射后角膜应力上升328. 9%；Wollensak等对兔眼进行核黄素-紫外线A照射后发现，前部角膜基质胶原纤维直径明显增粗（12. 2%），后部角膜基质纤维轻度增粗（4. 6%），从形态学上证实胶原交联可提高角膜的机械强度。Kohlhaas等（2006年）首次以精确的角膜厚度对交联效应进行定位，发现联合使用核黄素和紫外线A可使角膜硬度明显增加，该效应具有深度依赖性，这与紫外线A通过角膜基质时迅速衰减有关，65%～70%的紫外线A被前部200μm角膜吸收，因此，对深部组织如角膜内皮不产生明显影响。Spoeral等发现紫外线-核黄素照射后的猪前部角膜具有更高的抗热能力，有助于保护角膜内皮细胞和保持前角膜曲率，同时照射后的猪角膜对酶降解的耐受性明显增加。
多方面的研究逐步确定了相对安全有效的核黄素和紫外线A的使用剂量，为临床应用奠定了基础。临床研究方面，Wollensak等（2003年）首次将紫外线-核黄素胶原交联技术应用于临床，以期达到治疗圆锥角膜的效果，随访时间持续（23. 2± 12. 9）个月。结果显示该方法可阻止中晚期圆锥角膜的进展。其中，治疗后70%的患眼角膜最陡屈光力下降了平均2. 01D，65%的患眼视力轻度改善，随访期间角膜和晶状体保持透明，治疗前后角膜内皮细胞密度无明显变化，除治疗后早期（角膜上皮愈合前）出现轻度角膜基质水肿外，无持续性角膜上皮缺损或角膜瘢痕形成等并发症发生。共焦激光显微镜观察角膜最大交联深度至前部基质340μm，并在术后2周即可通过裂隙灯观察到交联区与非交联区之间的分界线。此后，在世界范围内，紫外线-核黄素胶原交联技术不仅在进展期圆锥角膜，而且在边缘性角膜变性以及LASIK术后角膜扩张等病变的治疗中均获得满意而稳定的疗效，临床观察时间最长者达6年。
目前文献涉及的紫外线-核黄素胶原交联方法大多建立在德累斯顿（Dresden）方法之上。具体步骤包括，术前确定角膜厚度至少400μm，使用毛果芸香碱缩瞳以减少紫外线A对晶状体和眼底的照射剂量，为利于核黄素弥散到角膜基质中，角膜表面麻醉后去除角膜中央7～9mm范围角膜上皮，采用0. 1%核黄素溶液（20%右旋糖酐作为溶剂）浸润去上皮区，以紫外线A（波长370nm，功率3mW/cm2，光源距离10mm）照射30分钟，照射过程中每隔5分钟点1次核黄素。最初的研究表明，由于角膜上皮的屏障作用，大分子的核黄素不能透过，在角膜上皮完整的情况下，难以产生满意的角膜基质内胶原交联反应。因此，为消除角膜上皮的屏障作用，增加核黄素的角膜基质内浸润，加强交联效应，这一技术包含了全部或部分角膜中央上皮的去除。而临床应用显示，去角膜上皮的操作可能与紫外线-核黄素胶原交联术后部分角膜并发症的发生有关，如角膜上皮愈合延迟、疱疹病毒性角膜炎复发、弥散性层间角膜炎、棘阿米巴性角膜炎以及角膜瘢痕形成等。因此，能否在保留角膜上皮的前提下完成紫外线-核黄素胶原交联成为这一领域最值得研究的课题之一。目前的尝试除了在胶原交联之前采用丁卡因、苯扎氯胺等药物松解角膜上皮屏障之外，飞秒激光的使用也为这一设想的实现带来希望。
近年来，飞秒激光已被成功应用于角膜屈光手术中角膜瓣的精确制作、角膜基质环植入手术中角膜隧道的完成、穿透或板层角膜移植手术中角膜供体和受体植片的可控性制备以及弧形角膜切开手术矫正散光的过程。因此，用飞秒激光制作一个预设的角膜基质口袋式腔隙，在不去除角膜上皮的前提下，实现核黄素的角膜基质内浸润，从而完成紫外线-核黄素胶原交联技术是完全可能的，即飞秒激光介导的胶原交联术（FS-CXL）。
FS-CXL的方法和临床疗效
对于FS-CXL这一新的尝试，到目前为止，仅有为数不多的文献进行了相关报道。Kanellopoulos AJ等（2009年）进行了FS-CXL的首次临床尝试，对10眼早期圆锥角膜的患者进行了治疗，随访时间平均26个月（18～36个月），为FS-CXL的临床应用提供了最初的数据。
患者入选标准：角膜地形图显示K值＞48. 00D和（或）下方角膜变陡＞1. 00D，角膜最薄处超过500μm，患者年龄超过18岁。
具体操作方法：包括角膜基质内口袋式腔隙的制作和紫外线-核黄素胶原交联。角膜表面麻醉后，采用飞秒激光仪（Intralase FS60，Abbott Medical Optics，Santa Ana，Calif），在角膜上皮下100μm处进行以瞳孔为中心，鼻侧带蒂，直径为7mm的基质内切削，切削区颞侧做一个10°边缘经上皮切口，使用Jameson肌肉拉钩从切口处进入角膜切削层间进行钝性分离，完成基质内口袋式腔隙的制作。随后，用25G针头将0. 1ml的0. 1%核黄素注入基质内口袋式腔隙中，重复两次，直至清晰可见腔隙内均匀充满亮黄色的核黄素溶液。核黄素浸润2分钟后，进行紫外线A照射，波长370nm，角膜表面的有效照射能量为7mW2/cm2，时间为15分钟，角膜9mm直径范围内总的照射剂量为6. 3J（下图）。术后用药包括抗生素和糖皮质激素滴眼液（每日4次，持续1周）。患者于术后1天、1周、1个月、3个月及之后每6个月进行随访。
手术步骤示意图
临床疗效：裸眼视力从20/50提高到20/40，最佳矫正视力无明显下降（保持术前水平20/20），平均球镜屈光度下降0. 5D，平均散光减少约0. 90D，平均最陡屈光力从49. 50D下降至48. 10D，角膜扩张停止进展，随访期间角膜内皮细胞数未见明显降低。术后早期（1个月）大约有5%的角膜出现厚度变薄，而在术后18个月时，5%的角膜最薄处厚度增加。所有患者术后1天即可恢复日常活动，在随访期内（18～36个月）未见明显不良并发症的发生。裂隙灯检查未见角膜上皮缺损和前2/3角膜基质的弥漫性光线散射现象。
国内董子献等（2011年）进行了FS-CXL的动物实验。具体方法为，首先，在兔角膜中央的上皮下80μm处用飞秒激光（VisuMax，Carl Zeiss Meditec AG，Germany）进行角膜基质内切削，切削直径为7mm，切削区颞侧做一个10°边缘经上皮切口，然后使用显微虹膜复位器进行角膜切削区层间钝性分离，形成基质内口袋式腔隙，注满0. 1%核黄素，浸润2分钟后，采用紫外线照射仪（UV-X；IROC AG，Zürich，Switzerland）照射紫外光A10分钟（370nm，3mW/cm2，紫外光距角膜表面10mm），于术后1天、1周、2周、1个月、3个月和6个月观察角膜地形图、角膜厚度等指标。观察发现，FS-CXL后1个月使用眼前节成像系统可观察到在角膜层间交联区与非交联区之间的分界线，分界线之前的角膜基质反光度高于分界线后的角膜基质，中央照射区的角膜厚度高于周边未照射区，FS-CXL后6个月组织学观察确证了交联区与非交联区之间胶原分界线的存在（下图）。此外，该研究还发现FS-CXL治疗后，除术后1个月，各观察时间点中央角膜厚度均高于术前，提示角膜胶原纤维的增生。
兔角膜FS-CXL后6个月，光镜可见交联区和非交联区的分界线（箭头所示）
FS-CXL的优势和不足
和传统的CXL相比，FS-CXL可能具有以下的优势。
- 更有效地进行角膜基质内CXL。在整个CXL过程中，起作用的要素是核黄素、紫外线A和角膜基质细胞，如果角膜基质是胶原交联的靶组织，那么使紫外线A直接与角膜基质内，而不是角膜表面的核黄素产生光氧化反应和生化反应，从而达到胶原交联的目的显然是更为有效的方式。传统的CXL中，紫外线A大部分被角膜表面浓厚的核黄素所吸收，因此需要加大紫外线的照射剂量和延长照射时间来产生足够的角膜基质内胶原交联反应。FS-CXL通过将核黄素选择性地直接注入胶原交联的目的地——角膜基质，从而实现了用低浓度的核黄素、低照射剂量和短照射时间的紫外线A达到满意的角膜基质内胶原交联反应，产生胶原纤维之间的连接，起到增加角膜硬度的目的。
- 减少核黄素和紫外线的耦合作用对眼内组织的损伤。传统的CXL为使角膜基质浸润足够的核黄素，和紫外线耦合产生胶原交联反应，则需要增加角膜表面核黄素的用量，这样，核黄素在眼内组织，如角膜内皮、前房、晶状体等组织中的浓度也相应地增加了。Kanellopoulos AJ等认为，在核黄素-紫外线胶原交联过程中，紫外线A照射本身对眼内结构并无影响，角膜前部300μm厚度范围内可吸收绝大部分的紫外线A，但如果紫外线A与眼内组织所存在的核黄素相结合，将对局部组织产生光化学损伤。FS-CXL由于是选择性的角膜基质内核黄素浸润，核黄素的用量减少，紫外线A照射时间缩短，因此不仅减少了眼内核黄素的渗透，而且减轻了由于核黄素和紫外线A耦合产生氧自由基以及长时间、大剂量的紫外线A照射对角膜基质、角膜内皮、虹膜以及晶状体组织的损伤。
- 术后恢复快，患者舒适度高。FS-CXL的操作过程中不包含角膜上皮的去除过程，因此患者术后不需要上皮的愈合，无疼痛产生。在Kanellopoulos AJ等的研究中显示，所有患者术后第1天术眼无痛，视力恢复至术前水平，无明显上皮缺损。角膜上皮的保留最大限度地减少了传统的CXL由于去上皮所造成的术后疼痛，角膜上皮延迟愈合以及角膜感染和后期角膜瘢痕形成等并发症的发生。
对于FS-CXL，最初的顾虑在于，使用飞秒激光制作角膜基质内口袋式腔隙的过程是否会对已经薄弱并扩张的角膜基质产生更进一步的生物力学不稳定状态。然而越来越多的证据显示，在飞秒激光制作角膜瓣的操作中，改变角膜生物力学的步骤是最后的角膜边缘环形切割，而不是角膜基质内切割的过程。因此，Kanellopoulos AJ等认为，在FS-CXL的关键步骤，即采用飞秒激光制作角膜基质内口袋式腔隙的过程中，角膜瓣切割区颞侧10°的边缘切口对角膜生物力学的影响是微弱的。动物实验也同样提示，FS-CXL并未导致角膜扩张，相反，在术后随访的6个月中，术眼角膜治疗区有逐渐变平坦的趋势。
虽然临床研究和动物实验初步证实了FS-CXL的可行性、安全性和有效性，但是这一技术仍然存在尚待回答的问题。首先，在FS-CXL过程中，由于核黄素选择性地直接注入角膜基质内，更接近角膜内皮层，因此核黄素的安全剂量和紫外线A的照射剂量需要进一步研究加以确定。其次，由于治疗对象的个体差异，交联后角膜机械强度增加可以持续多长时间，再次治疗的时机和效果如何，是否可从原切口再次注入核黄素进行照射，是否可在具有潜在角膜扩张风险的角膜屈光手术患者术中进行预防性FS-CXL以减少术后角膜膨隆的可能性，对以上问题的解答同样需要长期深入的研究。
对于已经存在角膜膨隆的患者，单纯行CXL只能起到稳定角膜生物力学的作用，而在降低角膜曲率、改善角膜屈光不正方面的作用并不显著。Stojanovic A曾成功地对圆锥角膜患者进行屈光矫正和胶原交联的联合治疗，即准分子激光经上皮个体化切削之后立即进行核黄素-紫外线胶原交联，术后不仅角膜膨隆得到稳定，而且患者的视力也得到提高，避免了二次屈光手术对已发生胶原交联的角膜基质进行切削的过程。那么同样，是否可以将屈光度的矫正和FS-CXL联合，在不影响胶原交联效果的前提下提高患者的视功能？对于这一设想，Kanellopoulos AJ等已进行了初步的尝试，选择43例没有临床圆锥角膜的高度近视患者，在FS-LASIK后，用0. 1%核黄素浸润角膜基质60秒，然后进行角膜瓣的复位和层间充分冲洗，之后进行紫外线A照射（370nm，10mW/cm2，3分钟），照射过程中保持角膜的湿润，术后平均随访3. 5年，经分析发现所有患者均显示较稳定的视功能、角膜曲率以及角膜厚度等，未发生角膜扩张和屈光回退的表现，体现出对有角膜扩张或屈光回退风险的人群进行FSLASIK联合预防性CXL手术对稳定角膜生物力学的长期安全性和有效性。
综上所述，本节以飞秒激光的性能为出发点，着眼于飞秒激光介导的胶原交联术（FSCXL）——针对角膜膨隆性疾病的新的治疗技术，重点阐述了CXL和该技术的基本原理及特点，相信在不久的将来，这一结合了飞秒激光和紫外线-核黄素胶原交联技术的高科技医疗手段，作为常规飞秒激光角膜屈光手术的补充，将得到更广泛的关注和更深入的研究。