精浆游离mRNA的分离与特点(男科学 精浆游离核酸的分离与应用)

国外对游离mRNA的研究开始于1999年，两个小组在肿瘤患者血浆中检测肿瘤来源的mRNA，一年后，Poon等在孕妇血浆中检测到胎儿表达的mRNA。目前，对于游离mRNA的研究成为一个新的热点，除血浆外，已在唾液、支气管灌洗液、尿液、精浆等体液发现有游离mRNA的存在，其中以血浆和唾液中游离mRNA研究相对较多。研究表明，尽管外周血和唾液中含有丰富的RNA酶，但游离于细胞外的mRNA确实存在，其来源尚不十分清楚，推测可能是细胞死亡后释放或活细胞分泌至胞外，并可能与其他物质结合，增加其稳定性，逃避RNA酶的降解作用。由于游离mRNA对其来源器官基因表达的全面代表性，加之分子生物学技术的快速、敏感而准确，及其快速发展趋势和前景，游离mRNA被认为在疾病诊断、法医鉴定、产前诊断等方面具有很好的应用前景。例如，可通过检测肿瘤来源的异常游离mRNA来诊断肿瘤，通过检测孕妇血浆中胎儿源性游离mRNA进行产前诊断等。

2009年，我们首次报道了精浆游离mRNA（cell-freeseminal mRNA，cfs-mRNA）的分离及一般特征，小结如下。

cfs-mRNA的分离

精浆也许是人体液中分离RNA最有挑战性的液体，主要是由于成分复杂，如含丰富蛋白和多糖，这些均不利于RNA的提取，以下方法是先用TRIzol LS粗取cfs-mRNA，然后再进一步用RNeasy Kit纯化。

一、器材准备：低温高速离心机，连续可调加样器（1ml，200μl，20μl）及相应加样枪头（RNase-free）。

二、试剂准备：TRIzol LS，RNeasy Kit，氯仿，异戊醇，无水乙醇。

三、实验步骤

1. 精液液化后离心获取精浆，为避免高速离心导致细胞破裂而有其他RNA“污染”，建议两步离心法（室温）：1600g，10min，然后收集上清液进行第二次离心，16 000g，10min，小心取上清液即为精浆。
2. 按4∶5（v/v）比例将离心后精浆与TRIzol LS混和，室温静置5min。
3. 加1/5倍于混和液体积的氯仿，剧烈振荡15s，室温静置5min；12 000g于4℃离心10min。
4. 取上层无色清亮液体，勿吸取有机层物质，按1∶1（v/v）与异丙醇混合，吹打混匀后室温静置10min。
5. 12 000g，4℃离心10min，去上清液，RNA沉淀用75%乙醇（用RNase-free水配制）洗涤2次后溶解于100μl RNase-free水中。
6. 100μl RNA加入350μl RLT工作液（RNeasy Kit），充分混匀；加入250μl无水乙醇，充分混匀后加到纯化柱中，8000g离心15s。
7. 加700μl缓冲液RW1到RNeasy Kit的吸附柱中。轻轻旋紧管盖，8000g于室温离心15s，对旋转柱膜进行清洗。
8. 弃去收集管中滤液，加入500μl RPE工作液，对旋转柱膜进行清洗。8000g离心15s；
9. 弃去收集管中滤液，加入500μl RPE工作液，对旋转柱膜进行清洗。8000g离心2min；
10. 弃去收集管中滤液，将纯化柱换入一个新收集管中，12 000g离心1min；
11. 将RNeasy旋转柱置于新的1.5ml收集管（RNase-free）中。轻轻旋紧管盖，在最大速度下离心1min。
12. 将纯化柱换入一个新的1.5ml EP管（RNase-free）中，在纯化柱膜中间加25μl RNase-free水，室温放置1min，12 000g离心1min；洗脱得到RNA。置-70℃保存。

cfs-mRNA的特点

一、含量与种类

对10例精液参数正常标本分析，cfsRNA含量范围为每毫升精浆0.87～3.64μg，平均含量为1.75± 0.92μg/ml。表达谱芯片结果显示，至少有12 000个基因mRNA存在于精液参数正常男性cfsmRNA中。

二、稳定性

由于精液中含有大量的RNA酶，在人精浆中加入大鼠睾丸RNA，15s后就已检测不到大鼠β-actin。但通过时间变化来分析cfs-mRNA的稳定性，与0min时间β-actin mRNA的量相比，β-actin mRNA的5′端、3′端及中段在24h内均无明显减少，说明精浆中β-actin mRNA是稳定的。与0min的时间DDX4 mRNA的量，DDX4mRNA的5′端在24h内稳定，而DDX4mRNA中段的含量在90min时开始慢慢减少，24h后已经降解到最初的25.8%。DDX4mRNA 3′端含量在20min已降到了27.4%，90min时已检测不到mRNA 3′端。这些结果表明，cfs-mRNA的稳定性是相对的，且依不同基因的mRNA而异，但5′端比较稳定。进一步对其存在形式的研究表明，cfs-mRNA主要被包裹于微小体中，而逃避RNA酶的降解。

三、完整性

利用RT-PCR，可以从cfs-mRNA中扩增出完整的基因mRNA，所以，虽然部分可能以降解形式存在，但仍有完整的cfs-mRNA。