精浆α-葡糖苷酶的检测(男科学 精浆的生物化学检查)

精浆α-葡糖苷酶来源于附睾（中性α-葡糖苷酶）和前列腺（酸性α-葡糖苷酶），前者约占80%，后者约占20%。因此，精浆α-葡糖苷酶的检测目前有两种方法，一是精浆总α-葡糖苷酶的检测，为目前我国男科实验室常用方法；二是精浆中性α-葡糖苷酶的检测，为WHO手册推荐方法，检测过程相对比较繁琐。临床意义：精浆总α-葡糖苷酶活性高低可反映附睾分泌功能。

精浆总α-葡糖苷酶的测定

一、检测原理

使用葡萄糖氧化酶法检测精浆总α-葡糖苷酶活性。麦芽糖含有两个吡喃型葡萄糖残基，由α-1，4-糖苷键相连，经精浆α-葡糖苷酶的作用，水解糖苷键生成葡萄糖。用葡萄糖氧化酶法可测定其生成量。1单位α-葡糖苷酶定义为每毫升精浆与底物在37℃水浴箱中温育30min产生0.1mg葡萄糖。

二、所用试剂

1. 醋酸盐缓冲液：0.1mol/L pH5.2。
2. 麦芽糖基质液（56mmol/L）：称取麦芽糖100mg，溶于5ml 0.1mol/L醋酸盐缓冲液中，用时新鲜配制。
3. Tris-HCl缓冲液：0.5mol/L pH7.0。
4. 葡萄糖标准液：5.56mmol/L。
5. 153.06mmol/L氯化钠溶液。
6. 葡萄糖氧化酶法测定试剂盒：市场广泛可得。

三、操作步骤

具体操作步骤见下表。

混匀，37℃水浴箱中温育15min后，用505nm波长，Bp管调零，读取吸光度值。结果计算：精浆α-葡糖苷酶活性（U/ml）=（U-Ub-Rb）/（S-Rb）×0.01×2×1/0.01÷0.1=（U-Ub-Rb）/（S-Rb）×20。

四、正常参考值

正常生育男性精浆总α-葡糖苷酶活性参考值为35.1～87.7U/ml。

精浆中性α-葡糖苷酶的测定

一、检测原理

前列腺分泌的酸性α-葡糖苷酶能够被十二烷基硫酸钠（SDS）选择性抑制，检测过程中加入SDS后，检测出的α-葡糖苷酶活性即为中性α-葡糖苷酶活性。WHO推荐的该检测方法原理为葡糖苷酶将合成的p-硝基苯酚-α-吡喃葡糖苷（PNPG）底物转化为对硝基苯酚（PNP），加入碳酸钠后变为黄色，然后在405nm下比色测定，通过与标准曲线的比较确定样本中中性α-葡糖苷酶活性。1IU葡糖苷酶活性定义为37℃水浴箱中温育每分钟生成1μmol PNP。

二、所用试剂

1. 缓冲液1（0.2mol/L磷酸盐缓冲液，pH6.8）：溶解4.56g K₂HPO₄于100ml纯水中；溶解2.72g KH₂PO₄于100ml纯水中。将两者等量混合至pH6.8。
2. 缓冲液2：溶解1g SDS于100ml缓冲液1中。
3. 显色剂1（0.1mol/L Na₂CO₃）：溶解6.20g Na₂CO₃•H₂O于500ml纯水中。
4. 显色剂2：溶解0.1g SDS于100ml显色剂1中。
5. 5mg/ml底物PNPG：溶解0.1g PNPG于20ml缓冲液2中，并在50°C的加热板上搅拌约10min。一些晶体可能仍然不溶解。使用过程需将溶液贮存于37℃水浴箱中。每次分析制备新鲜溶液。
6. 用于精液空白的葡糖苷酶抑制剂（澳粟精胺，10mmol/L）：溶解18.9mg澳粟精胺于10ml纯净水中，用纯净水稀释10倍成1mmol/L的工作液，分装成1ml-20℃冻存。
7. 用于产物PNP的标准曲线溶液（5mmol/L）：溶解69.5mg PNP于100ml纯净水中，必要时加热溶解。用铝箔包裹或装在棕色玻璃瓶中4℃避光保存，每3个月制备新鲜的标准溶液。
8. 制备标准曲线的溶液（在孵育的最后一个小时内完成）：加400μl 5mmol/L PNP贮存液于10ml试管中，加显色剂2（200μmol/ L）至10ml，用显色剂1稀释200μmol/L标准得到4个标准液，160、120、80和40μmol/L PNP。
9. 用冻融的混合精浆做室内质量控制。

三、操作步骤

基本操作步骤为：

1. 精液分析后3000g离心剩余的精液样本15min，取去精子的精浆贮存于-20℃待分析。
2. 溶解去精子的精浆并充分混匀，同时溶解用于内部质量控制的混合精浆。
3. 在2个1.5ml试管中用正向移液器分别加15μl精浆标本，同时设两个空白（15μl纯水）和4份（各15μl）内部质量控制精浆样本。
4. 在两个内部质量控制样本中加8μl 1mmol/L澳粟精胺以提供精浆空白值。
5. 加100μl PNPG底物溶液至每管中，混匀每管，37℃孵育2h。
6. 2h后加1ml显色剂1并混匀终止孵育。
7. 将250μl样本和标准液转移至96孔板中；1h内在405nm波长下用水空白调零读取结果。
8. 通过比较吸光度值，从标准曲线上读取标本产生的PNP浓度。
9. 乘以校正因子［为0.6194，即经过120min反应，在1.115ml总体积中，从15μl精浆得出的活性，因此，校正因子为（1115/15）/120=0.6194］，得到未稀释精浆中性α-葡糖苷酶活性（IU/L），再乘以精液总体积即为每份精液的α-葡糖苷酶活性（mU）。

四、正常参考值

正常生育男性精浆中性α-葡糖苷酶为每次射精精液≥20mU。

方法学评价

精浆总α-葡糖苷酶活性的测定包含约20%的来自前列腺的酸性α-葡糖苷酶，因此其总活性值可能受到前列腺分泌功能的影响，但其操作简便，影响因素少。而WHO推荐的中性α-葡糖苷酶活性检测中，由于SDS溶液储存很容易发生沉淀，且用于检测的底物PNPG常有结晶难以溶解，这给实际操作带来很大的不确定性，而且，其操作步骤较为繁琐，且每次分析均需制备标准曲线，十分费时，不易在临床推广。

为了保证精浆α-葡糖苷酶活性检测结果的准确可靠，应注意三点：①离心分离获得精浆标本时，至少3000g离心15min。WHO推荐的离心速度为1000g离心10min，但以此离心速度分离获得的精浆中仍含有大量精子，其检测出的α-葡糖苷酶活性显著高于3000g离心15min获得的精浆。这可能与精浆中残存的精子、细胞或非细胞成分有关，因为精子顶体中含有α-葡糖苷酶，前列腺分泌的非细胞组分中亦含有α-葡糖苷酶。②精浆总α-葡糖苷酶活性与禁欲时间的长短密切相关。禁欲时间越长，α-葡糖苷酶水平越高。禁欲4～5d和禁欲6～7d的结果之间没有显著性差异，而禁欲2～3d的精浆α-葡糖苷酶水平明显降低，禁欲7d以上的精浆α-葡糖苷酶水平明显升高。③每批精浆α-葡糖苷酶活性的检测中均应包括高、低浓度的两种室内质控品，这可通过混合精浆分装冷藏获得。而且，每次更换新的不同批次的试剂时，应以质控品结果作为参考，结果的一致性应在10%之内。