精子成熟度的核组蛋白染色、核DNA检测(男科学 精液细胞染色技术)

精子核组蛋白染色

苯胺蓝染色法

在精子形成阶段，精子核中组蛋白的类型由富含赖氨酸的组蛋白逐渐被富含精氨酸的精核蛋白所取代，因此组蛋白的多少是精子成熟程度的一个重要指标。苯胺蓝能特异性地与精子核组蛋白富含的赖氨酸残基结合，使含组蛋白的精子被染成蓝色，根据着色的深浅来判别精子的成熟程度。

试剂配制：

1. 4%戊二醛固定剂：用0.2mol/L pH7.4的PBS 50ml与25%的戊二醛16ml混合，加蒸馏水至100ml即成。
2. 苯胺蓝染色液：苯胺蓝染料5.0g溶于4%的醋酸水溶液中，调整pH至3.5即可。

染色方法：

1. 取液化精液2000r/min离心10min，沉淀用等渗盐水洗3遍，涂片后自然干燥；
2. 4%戊二醛固定20min，蒸馏水洗15min，共2次；
3. 5%苯胺蓝染色5min；
4. 流水冲洗5min，蒸馏水冲洗2次；
5. 50%、70%、80%、95%、100%梯度乙醇各浸1～2min，二甲苯透明，中性树脂封片。

磷钨酸染色方法

染色原理：磷钨酸能特异性地与精子核组蛋白中的赖氨酸残基结合，在电子显微镜下呈较高的电子密度。

2.试剂配制

1. 按常规配制0.1mol/L和0.2mol/L PBS及4%戊二醛固定液；
2. 取磷钨酸3g加入无水乙醇100ml中配制成3%磷钨酸乙醇溶液；
3. 包埋液的配制：分别取环氧树脂4.5g，DDSA 4.5g，DBP 0.15g，DMP-30 0.075ml混合后于加热搅拌器上轻轻搅拌，注意不能起泡，60℃，30min，然后置于37℃恒温箱中备用。

3.染色方法

1. 取液化精液1.0ml加入0.1mol/L PBS 3.0ml，2000r/min离心5min后洗涤，共3次，弃上清液留取沉淀部分；
2. 在沉淀上小心加入2.0ml 4%戊二醛，4℃环境中固定2h；
3. 轻轻取出沉淀精子，用0.1mol/L PBS浸洗3次，4℃环境中每次间隔1h；
4. 30%→50%→70%→80%→95%→无水乙醇逐级脱水，各10min；
5. 3%磷钨酸乙醇溶液中过夜，20℃，16h；
6. 用环氧丙烷浸透，20℃，15min，2次；再入包埋液环氧丙烷（1∶1）混合液中1h，20℃，然后在2∶1混合液中20℃过夜；次日入包埋液6h，其中20℃，2h，37℃，4h；
7. 将精子小块与包埋液一起放入包埋后的孔内，60℃烘箱内48h；
8. 切片后电子显微镜观察。

精子核DNA检测

染色原理：含有双链DNA的精子才有受精能力。荧光染料吖啶橙与双链DNA结合后发出绿色荧光，如和单链的DNA结合则发出红色或黄色荧光。

试剂配制：分别取吖啶橙0.1g，枸橼酸1.91g，磷酸氢二钠10.74g，各加入蒸馏水100ml溶解，贮存于4℃备用。临用前按吖啶橙1.0ml，枸橼酸4.0ml，磷酸氢二钠0.25ml的比例配制。

染色方法：

1. 取液化精液2000r/min离心10min，沉淀用等渗盐水洗3遍，涂片后自然干燥，甲醇固定10min。
2. 新鲜配制的吖啶橙染液染色50min。
3. 流水冲洗晾干，荧光显微镜观察。