胰岛移植实验研究：分离与纯化、胰岛细胞培养(糖尿病学 胰岛移植治疗糖尿病的研究)
早在1970年Younszai等首先报道了腹腔内移植成年大鼠胰岛使糖尿病状态暂时减轻。随后1972年Ballinger与Lacy将400～600个胰岛分别移植到近交系（自体移植）和非近交系（同种异体移植）糖尿病大鼠腹腔内，并获得持久的作用，与对照组比较，胰岛移植后大鼠糖尿病部分缓解，生存期延长。接着Richard等报告移植较大数量的胰岛，使糖尿病大鼠血糖完全恢复正常长达7个月之久。至今30余年间胰岛移植实验研究广泛深入地开展，取得了很大的成果。胰岛移植步骤可以简单概括为供胰消化后胰岛分离纯化，体外培养，胰岛植入和受体免疫抑制和免疫耐受治疗以维持胰岛存活与功能。胰岛移植必须解决的技术关键包括：胰岛分离、培养、鉴定、保存；感染和自身免疫介导的移植排斥；血管再生；低移植量和高代谢需求的矛盾；临床广泛需求而胰岛供量有限的矛盾。目前胰岛移植的主要障碍是受体终生使用免疫抑制剂。一旦这一障碍得以克服，胰岛供量有限将成为主要矛盾。胰岛移植的实验研究发展对于推动胰岛移植的临床应用至关重要。
胰岛的分离与纯化
胰岛仅占胰腺体积的1%～4%。通过胰岛分离与纯化去除胰腺外分泌组织，可以提高移植物植入量、增加安全性、减少移植物免疫原性，免疫调节过程也需要胰岛纯化。由于胰岛细胞和胰腺外分泌组织细胞体积差异很小，早期的尼龙膜过滤、沉淀、离心洗涤、等速梯度离心等方法不能有效提高胰岛纯度。目前常用的方法为胶原酶消化后Ficoll密度梯度离心纯化胰岛。
啮齿类动物胰岛分离纯化
成年大鼠麻醉后，经肝门胆总管内插管，逆行注入Hanks液，充分膨胀胰腺后摘除胰腺组织剪碎，经Hanks液漂洗后通过胶原酶消化，Ficoll间断密度梯度离心纯化胰岛，每只成年鼠一般可分离获得200～400个胰岛，得率约5%～10%。胡远峰等采用改良的胰管内灌注胶原酶溶液消化与Ficoll密度梯度离心法研究成年大鼠胰岛分离与纯化，胶原酶溶液中添加7. 5mmol/L CaCl2，pH 7. 8，38℃±1℃水温内消化，可显著提高胰岛得率，同时避免产生胶样物造成胰岛损失。并采用中性红原位活体染色，以鉴别与计数胰岛，平均每个大鼠胰腺得率为420～890个胰岛，Ficoll纯化后的胰岛平均收获量为212～455个，回收率约为50%，纯度为90%，胰岛活率在90%以上。胰岛呈猩红色细胞团，形态结构完整，胰岛素释放试验显示，纯化的胰岛具有良好的胰岛素分泌功能。
新生大鼠胰腺中的胰岛数量较多，胰岛素含量较高，外分泌酶含量低，仅用胶原酶消化分散，不需作胰岛分离即可移植。胎鼠胰腺中内分泌细胞发生早，当腺泡细胞尚未分化时，胰岛已能合成胰岛素与胰高血糖素。Hegre等将受孕16～22日的胎鼠胰腺做组织培养，所产生胰腺组织的25%由胰岛细胞构成，胰岛素含量为17mU/mg胰腺组织。胎胰胰岛发育的潜力与胰腺体外培养的时间密切相关，将已高度分化的胎鼠胰腺组织体外培养8日后，胰岛形态与数量均无明显变化，将分化较低的胎胰组织体外培养4日后，胰岛比例与胰岛素含量增高10倍。胚胎胰腺培养可促进腺管上皮细胞增殖，胰岛细胞选择性分化生长。
其他大动物胰岛分离纯化
由于大动物如猪、狗等胰腺组织结构与成人相似，纤维组织均较丰富，用手工消化较困难，可参照Ricordi建立的成人胰腺消化分离方法，近来多为胰管内灌注胶原酶进行消化，Ficoll密度梯度离心法分离胰岛。通过自动化装置使胰岛在恒温消化过程中逐渐释出，避免了胶原酶对胰腺的过度消化，同时还由于人为干预少，大大降低了污染率，提高了胰岛收获率。该方法的关键是最小的机械损伤和持续胶原酶消化，胰岛释放而避免过度消化。
胰岛分离纯化方法的改进
消化酶现多用释放酶（liberase），它含有从溶组织梭状芽孢杆菌高度纯化的胶原酶Ⅰ、Ⅱ的异构体，以及从嗜热溶蛋白杆菌分离的嗜热菌蛋白酶。后者可以提高对细胞外基质成分（extracellular matrix）的降解作用，而有效提高胰岛分离。由于减少了裂解作用的酶活性，故可保护胰岛的完整性。释放酶的活力强、纯度高、毒性小，而且不同批号间酶活性相当稳定，用释放酶消化分离的胰岛不仅得率大大提高，而且胰岛的活性亦明显增加。释放酶目前亦已广泛用于大动物和啮齿类动物的胰岛分离。近来德国Serva研制一种用于成人胰岛分离的新型消化酶，称为Serva胶原酶NB1（胶原酶NB1添加中性蛋白酶），胰岛得率与释放酶类似，而用胶原酶NB1胰岛形态学改善，凋亡细胞比例减少，且没有批号间酶活性变异，被认为有望成为人胰岛分离的专用消化酶。
在密度梯度离心纯化胰岛方面，早期离体研究用非连续蔗糖梯度离心方法分离大鼠胰岛和外分泌组织，发现可能由于高渗损伤胰岛细胞脱水导致胰岛对高糖刺激无反应，而高分子聚蔗糖Ficoll梯度离心方法可以有效提高胰岛活性。一些研究表明其他介质，包括水溶性聚蔗糖Euro-Ficoll、牛血清白蛋白、泛影酸钠-Ficoll、甲泛葡胺、泛影葡胺，进行密度梯度离心纯化胰岛，可不同程度提高胰岛得率。近有报道用葡聚糖Dextran M70或Histopaque-1077代替Ficoll，可提高胰岛的活率和得率，Dextran M70价格便宜，Histopaque-1077较Ficoll能提供一个更好的渗透环境，更好地保护胰岛活性与功能，且纯化方法简便。
供胰的内源性蛋白酶和相应的抑制成分影响胶原酶的蛋白裂解活性、消化时间、胰岛得率和活率，因而对于胰岛消化过程非常重要。胰蛋白酶具有裂解胶原酶活性，消化过程中供胰的胰蛋白酶活性增加与胰岛得率和活率降低密切相关。广谱丝氨酸蛋白酶类抑制剂4-（2氨基乙烷）-氟氢氯酸苯（pefabloc）可以抑制胰蛋白酶活性，提高胰岛得率和活率。有研究报道pefabloc提高冷缺血时间较长的胰岛得率，但未发现pefabloc对消化时间的显著改变，提示其他蛋白酶可能也参与了胶原酶活性的改变。
实验室胰岛纯化研究进展包括γ射线辐照、抗腺泡细胞毒抗体、激光选择性破坏腺泡、低渗环境破坏腺泡、抗腺泡单抗磁珠筛选、流式细胞分选术等多种方法，可以不同程度地提高胰岛得率。
胰岛细胞培养
胰岛细胞培养是体外保存胰岛的方法之一，且可使胰岛纯化、免疫原性降低。胰岛细胞培养需要解决一些特殊问题：首先由于胰岛细胞团体积较大，胰岛中心氧供不足可能发生坏死；其次胰岛培养与其他细胞培养技术的评估和比较不同；同时不同物种的胰岛培养技术和生物学行为不同。胰岛移植应避免污染，尽管胰岛污染与冷冻保存的胰岛有关，但胰岛移植前增加的任何步骤均可能增加胰岛污染的可能性。
胰岛细胞培养方法
将已消化分离的胰岛按一定的密度接种于培养瓶或多孔细胞培养板中，培养液通常采用RPMI 1640或DMEM。氧浓度影响胰岛细胞胰岛素释放，推荐胰岛培养液厚度大约2mm为宜。培养温度对于胰岛免疫原性和存活率均有影响。胡远峰等对人胎胰岛细胞单层培养做了研究，培养24小时后将胰岛转入另一个培养皿，48小时后用新鲜配制的2. 5μl/ml碘乙酸处理5～6小时，以去除成纤维细胞，必要时2～3日后重复碘乙酸处理。在细胞培养过程中定期用倒置显微镜观察细胞生长状况，醛复红与免疫酶标染色或电镜观察。生物学活性鉴定采用胰岛素释放试验与细胞内胰岛素含量测定。经胶原酶消化分离可得到分散较好的细胞与细胞团，活率在85%以上，平均细胞获得率为0. 6～1. 2× 105/mg。胰岛细胞比例因供体胎龄而异，一般含分泌颗粒细胞至少占1/5，其中绝大多数为β细胞，培养2周后胰岛细胞对高糖加茶碱刺激呈现良好的应答反应，表明人胎胰岛细胞单层培养方法不仅可以促进胰岛细胞的生长与纯化，而且可减低其免疫原性。
不同培养液影响胰岛细胞存活与功能，有研究比较TCM 199、RPMI 1640、CMRL 1066、MEM、Ham’s F10等不同胰岛培养液的效能，发现F10培养的胰岛细胞内胰岛素含量最高，而RPMI培养的胰岛细胞胰岛素合成率最高。RPMI培养液中的烟酰胺和11mmol/L葡萄糖可能与此相关。另有研究认为MEM是大鼠胰岛最佳培养液，F12是猪胰岛的最佳培养液，而CMRL 1066是人胰岛的最佳培养液。
胰岛细胞增殖分化研究
研究发现胰岛细胞与导管细胞共同培养比单纯胰岛细胞培养增殖率高。导管细胞释放的因子可能对胰岛细胞生长有促进作用。人生长激素、胰岛素样生长因子Ⅰ（IGF-Ⅰ）和胰岛素样生长因子Ⅱ（IGF-Ⅱ），转化生长因子α（TGF-α），表皮生长因子（EGF），烟酰胺等均对胰岛细胞增殖和分化有明显的促进作用。人生长激素可促进人胎胰岛细胞在体外培养中贴壁、铺展与细胞单层形成，3HTdR掺入试验显示人生长激素可明显促进胰岛细胞DNA复制，有丝分裂指数从2. 36%增加到5. 95%。人生长激素还能促进胰岛β细胞的胰岛素的合成与释放，并能增强胰岛β细胞对葡萄糖刺激的反应性。近期研究发现胰高血糖素样肽1 （GLP-1）、17β-雌二醇、烟酰胺等可能通过抑制氧化应激和致炎细胞因子机制对胰岛细胞生长有促进作用。