细胞培养技术（相关方法步骤、注意事项）(内分泌学 内分泌代谢研究技术)

细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。培养物多为单一细胞群，特殊情况下可用不同组织来源的细胞共同培养。目前，细胞培养不仅是生命科学理论研究的重要技术，细胞移植和细胞治疗也逐渐应用于临床，而且已成为生物工程和基因工程的生产手段。

因体外培养的细胞与机体细胞一样，能分泌各种酶和蛋白质，因而细胞培养日益成为生物工程药物（如各种抗体）和基因工程药物的生产手段。将外源性的目的基因导入细胞，连接合适的启动子，细胞在一定的诱导条件下便能表达目的基因的产物，且在真核生物细胞中表达的产物，其活性普遍比原核生物中的要高。

因器官移植具有强烈的免疫排斥反应，因而细胞移植得到广泛的发展，而且目前的大多数基因治疗均是以细胞作为载体，将目的基因导入细胞，植入机体，导入的基因便可代替缺陷的基因发挥正常作用，有些细胞如杀伤细胞（TIL细胞）、Lark细胞等本身对癌细胞有杀伤作用，将这些细胞植入机体后，便能杀死癌细胞，从而起到治疗作用。

机械法或酶消化法分离组织细胞

前者指用机械手段如剪刀、玻璃注射器芯、细胞匀浆器等将组织块变成小于2mm³的组织甚至单个的细胞或细胞团；后者指用能分散细胞外基质的酶将细胞从其支持组织中分离出来。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。实际应用时，针对不同的组织来源，可采用不同的类型和酶浓度。

经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。

1. 筛网过滤法：选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌筛网过滤，孔径比细胞大的物质留在筛网上。该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块（如除去包膜的脾脏细胞）是有效的，而对于其他细胞（如胰岛细胞）则需进一步纯化。
2. 密度梯度离心：使用不同浓度的Ficoll（含葡聚糖）形成密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞。经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。
3. 显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层：为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的。
4. 选择性培养：在培养液中加入非目的细胞的特异性抑制物，使非目的细胞不能增殖并诱发其凋亡，从而使细胞达到纯化。该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。
5. 流式细胞分选技术：将细胞荧光染色（对细胞无毒）后，在稳定的液流推动装置作用下，通过直径为50～100μm的小孔并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离。
6. 共聚焦激光扫描显微镜技术：利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆黏附细胞。
7. 免疫磁珠分离技术：其基本原理是基于细胞表面抗原与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相结合的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该表面抗原的细胞由于不能与连接磁珠的抗体结合而没有磁性，不能在磁场中保留而被清除，从而使细胞得以分离。

根据目的选择培养液及其组分

来源于体液的细胞宜选用RPMI1640培养，贴壁培养的细胞可选用DMEM、MEM、F12、McCoy’s 5A、F10或DMEM/F12混合物。其中F12和F10常用于成纤维细胞培养，DMEM、MEM和McCoy’s 5A常用于上皮细胞培养。同一类型的基本培养液其组成成分不同，有高糖型和低糖型，有些含有酚红。对于高糖需要型细胞（如胰岛细胞培养），则选用高糖型培养液。而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法见下表。

动物血清常用5%～15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中的各种生长因子、激素及免疫球蛋白等吸附去除（炭吸附血清，CS-FBS），以满足细胞培养中的特殊需要。笔者用0.1% BSA（牛血清白蛋白）代替CS-FBS用于肿瘤细胞的培养，效果良好。同时市面上有去除不同细胞因子和激素的血清替代物（serum replacement）出售，它们亦能满足特殊培养中的部分需要。

将分离后的细胞加入适量培养液（占培养空间的5%～20%，V/V），置于37℃、5%CO₂、95%空气及饱和湿度下培养，而昆虫细胞如Sf9细胞的最适培养温度为27℃。原代贴壁培养的细胞在培养的前2～3天保持不动，以保证细胞有充足的贴壁时间，过早搬动则会导致细胞不能贴壁；继代培养的细胞贴壁相对较快，肿瘤细胞更快，在接种的24小时内基本上已能贴壁。有些组织来源的细胞在玻璃或常规聚合材料制成的培养瓶中较难贴壁，须在瓶壁上附一层基质如鼠尾胶原等，这样更能保证培养细胞的功能接近于体内。

85%～95%汇合是传代培养的最佳时机，用胰酶或EDTA将细胞进行消化（有些贴壁不紧的肿瘤细胞只需轻轻吹打而不需消化就能将细胞分散），使细胞回缩呈透亮的圆形，加入冷的Hanks液终止消化，离心收集细胞，按1∶2至1∶4将细胞分成等份继代培养。

培养细胞研究必须检测细胞参数

各种细胞既具有相同的特性，又有其独有的特性。本节所介绍的是各种细胞共有特性的检测。

1. 细胞形态学观察：生长状态良好的细胞，镜下可见细胞透亮、轮廓欠清，胞内无异常颗粒，原代的正常组织细胞常呈规律排列，而肿瘤细胞排列比较杂乱。细胞功能不良时，透光性下降，轮廓增强，胞内常出现不透明的异常颗粒及空泡、脂滴等，细胞被微生物污染时，培养基变浑浊或瓶内出现异常生长物，细胞形态发生改变，生长缓慢甚至脱落，镜下亦可见有异常活动的微生物出现。同时还可将培养液取出少许涂片，乙醇固定，Giemosa染色后油镜下观察微生物形态。如怀疑有衣原体或支原体污染，可用低张处理的嗜伊红染色观察。
2. 细胞生长曲线绘制：将消化后的细胞接种24孔板，分7组，每组3孔，培养1周。每天取出一组细胞，胰酶消化后制成细胞悬液，用计数盘或细胞自动计数器计数，取3孔的平均值直至第7组结束，用坐标图纸绘制成生长曲线。
3. 有丝分裂指数（mitotic index，MI）：是指被测细胞群每1000个细胞中的分裂细胞数（分裂细胞/1000），用以表示细胞增殖旺盛程度。因此在检测中需观察和记录群体中1000个细胞中的细胞分裂象数，即细胞分裂指数＝细胞分裂相数/1000个细胞×100。具体方法是在培养瓶中加无菌洗净的盖玻片，每日从瓶中抽出盖玻片进行固定、染色（对于悬浮培养的细胞，取1滴细胞悬液滴片，固定），制成永久性标本。镜下观察分裂象并计数。取得逐日分裂象计数后，可绘成细胞分裂指数曲线，如图1-3-5。
4. 流式细胞计数检测细胞周期时相和DNA合成：当细胞培养至80%左右汇合时，胰酶消化细胞，制成单细胞悬液，在流式细胞仪上测出细胞所处的周期相（G₁、G₂、S、M期）和DNA合成的周峰期，同时可测RNA含量。
5. 细胞内总蛋白含量测定：将细胞用各种缓冲液裂解，离心后取上清，测其中蛋白质浓度，测定时用牛血清白蛋白作为标准。根据不同蛋白浓度的标准液所对应的吸光值，分光光度计可自动得出所测样品的蛋白质浓度。
6. 细胞存活与增殖检测：检测细胞存活数的常用方法为溴化3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑蓝（3-［4，5-Dimethylthiazol-2-yl］-2，5-diphenyltetrazolium bromide，Thiazolyl blue，MTT）试验，其原理是哺乳类动物细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能够将黄绿色的MTT盐还原成蓝紫色的甲臜（formazan）颗粒，以颗粒溶解后呈现的颜色深浅反映细胞活性，用酶联免疫检测仪测定甲臜的含量就可以定量测定细胞的存活总数。测定细胞增殖的方法为³H-TdR或BrdU掺入法，它们能在细胞有丝分裂过程中的DNA合成期掺入细胞内，通过液体闪烁计数仪检测掺入率。

用不同方法制备永生细胞株

原代培养的正常细胞特别是内分泌细胞，其增殖能力有限甚至有的根本不能传代，有的即使能传代，但失去了大部分正常成熟细胞的特性。因而必须将它们变成永生性细胞，以利于进一步的研究，但同时要设法保留原有细胞的大部分功能特性。常用的方法为人工诱变，即用射线、温度、药物、病毒和化学致突物诱导细胞突变。其中以病毒和化学致突变物常用（所用病毒一般为基因缺陷型病毒，它们丧失了在体外感染人和动物的能力；化学致突变物常为强烈致癌剂，使用时一定要加强防护），如用EB病毒可转化正常人外周血淋巴细胞，腺病毒可转化肾小管上皮细胞。

细胞分裂指数和细胞数量的关系

注：分裂指数是指每1000个细胞的分裂象数，接种后48～72小时细胞分裂达高峰；细胞数指接种细胞数和增加细胞数的总和，接种后24～72小时细胞数增加最快，96小时后增加较少

大部分细胞株的建立是直接取肿瘤组织进行分离培养，肿瘤细胞虽然为低分化细胞，但同时也具有部分分化细胞的特性，因而在研究分化细胞某一方面的特性时，常可用某一类似的细胞株来代替，目前在内分泌方面常用的细胞株如下表。

细胞冻存和复苏须保证细胞质量和基本生物学特性

部分内分泌常用细胞系

某一培养物建成后，如暂不使用，可冷冻保存。细胞消化后，离心收集，用冻存液［完全培养基加5%～10%的二甲基亚砜（DMSO）或灭菌甘油］ 重悬细胞，使细胞数为4×10⁶个/ ml，以1ml/管装入冻存管，经程序性降温后最终放入液氮中长期保存。如果无程序降温仪，可将细胞在4℃放2小时，然后转入-70℃放置12～24小时，最后快速转入液氮中保存。当要使用该细胞时则可从液氮中取出细胞，放入39℃温水中快速解冻，解冻时间不要超过1分钟。见细胞完全解冻后，便从温水中取出，尽快用缓冲液离心洗去DMSO，重新加培养液培养。

药物测试包括浓度和给药时间及给药后指标

新药在应用于临床之前，需进行药效检测。细胞培养能使药物与靶细胞直接接触，如防治糖尿病药物直接与胰岛接触，抗骨质疏松药物直接与成骨细胞或破骨细胞接触。有时甚至可以将药物显微注入细胞内，能使细胞较快地发生反应，避免了动物实验中药物引起靶腺反应周期长等缺点，且细胞发生的各种改变可通过多种方法检测。药物细胞测试时，被检测的药物最好为水溶性，以便选择对照。如果药物为非水溶性，应安排一组溶剂对照以排除溶剂对细胞的影响。同时必须考虑到溶剂的浓度不宜过高，否则会因为对细胞的影响太大而掩盖药物的作用。

药物浓度

体外培养的细胞所处的微环境有别于体内，对药物的耐受性也可能不同，一般选用体内生理浓度的近似值，同时向上向下拉开2～3个浓度梯度，如某一药物体内的生理浓度为10^-8mol/L，则应选用10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L等进行处理，如为复方制剂或无体内生理浓度参考值，则应测出药物对该细胞的半效应量（media infective dose，ID50）。方法是将药物分成不同的浓度梯度，用这些浓度的药物干预细胞，台盼蓝染色观察细胞死亡一半时的浓度，即为半效应量。然后在该浓度上下寻找精确的最佳浓度，药物试验一般每组需设3个以上平行孔/瓶，特别是要对细胞进行免疫检测和放射性分析时，平行孔/瓶最好达到5个以上。

给药时间

可于接种前和生长中给药，以生长中给药常用。根据不同的检测目的，生长中给药的时间不同，如测药物对细胞内某一蛋白磷酸化的影响，给药时间应以起初的5分钟为起点递增，最长不要超过3小时；检测药物对某一代谢分泌产物的影响时，可在接近该分泌产物达最高前给药，药物处理时间一般不得少于8小时，最长可与细胞培养时间同步；具体给药的时间还要视靶细胞的倍增周期及药物的作用机制来决定。

给药后的检测

给药后检测的方法较多，包括细胞增殖、信息的传递、基因的表达、酶或蛋白质的分泌等。要注意的是在检测酶或蛋白质的分泌时，要注意保持其活性，大部分操作最好在低温下进行。