miRNA与正常和病态造血(血液病学 造血及其调控)

近年来，一类核糖核酸小分子（即microRNA 或miRNA）成为全球生命科学、生物医学、药物学等诸多领域关注的焦点。具有调节功能的非编码小分子RNA是指一类内源性长度为21～24nt的单链核酸小分子，通过与靶基因3'-UTR区的完全或不完全互补结合，从而引起mRNA的降解或翻译抑制发挥负性调节作用。小分子RNA大多在进化上具有序列保守性，不编码蛋白质，而是以RNA的形式，通过调节一些信号分子，如生长因子、转录因子、前程序性细胞死亡基因和抗程序性细胞死亡基因的表达，实现对细胞死亡、增殖、分化、发育和新陈代谢的调控。小分子RNA的发现不仅揭示了困扰科学家们多年的基因沉默现象的本质，还改变了人们对基因的传统认识。miRNA的发现是近年来生命科学研究的一个重大突破，在2002年和2003年连续两年被《Science》杂志评为“年度十大科技进展”。

miRNA的生成主要包括两个过程。首先在细胞核内编码miRNA的基因由RNA聚合酶Ⅱ（RNA polⅡ）转录生成单顺反子或多顺反子初级转录物（Pri-miRNA）。Pri-miRNA随后进入微处理器Drosha（一种RNaseⅢ酶），在此被切割成60～70nt的一端5'磷酸，一端3'端两个悬垂结构的miRNA前体——pre-miRNA。pre-miRNA在Ran-GTP依赖的核质/细胞质转运蛋白Exportin5的作用下，从细胞核运送到细胞质中，然后被另外一种RNaseⅢ核酸内切酶复合物剪切成21～25个核苷酸长的miRNA：miRNA*双体。此复式结构在解旋酶作用下，一条链被降解（通常是miRNA*），而另一条链（通常是miRNA）进入核蛋白复合体形成RISC（RNA—induced silencing complex，RNA诱导的沉默复合体），发挥生物学作用。

根据与靶基因互补程度的不同，miRNA作用机制分为两种：靶mRNA切割和翻译抑制。miRNA同蛋白编码mRNA完全或几乎完全互补时，通过RNA介导的干扰途径，即miRNA相关的核糖核苷酸和miRNA诱导的沉默复合物（RNA induced silencing complex，miRISC）联合作用，降解靶mRNA。大多数动物体内，miRNA并不直接降解靶mRNA，而是与其3端非翻译区（3'-UTR）不完全互补，同样通过RISC或RNA干扰途径明显抑制转录后翻译水平的基因表达。miRNA运用此机制亦能降低相应靶基因的蛋白表达水平，不影响mRNA本身。

对于miRNA的最早研究是1993年Lee等用正向遗传学的方法在秀丽线虫中发现了第一个miRNA lin-4；lin-4有两种形式，一种是60nt长度，另一种是22nt的长度，均可形成茎环状的发夹结构，但22nt长度的可以通过与lin-14 mRNA 3'-UTR以不完全匹配的形式抑制lin-14基因的表达。2000年Reinhart等在秀丽线虫发现了另一个miRNA lin-7。lin-7的发现具有重要的意义，因为，不同于lin-4，lin-7在多种生物中表达，有较强的保守性，说明miRNA介导的基因调控具有比以往想象的更古老也更普遍的规律。随后，科学工作者采用多种方法寻找miRNA分子，迄今在人类组织中发现大约六百多条此类分子。而预测人体内约有一千条这样的小分子，它们调控约1/3人类基因的翻译表达。

miRNA在正常造血中的作用

造血是多层次复杂调控过程，涉及造血干细胞自我更新和向不同形态及功能的血细胞分化、成熟。这些过程受严格的调控，这些调节机制的分子性质尚知之甚少，目前的研究成果多集中于转录因子的转录调控。随着miRNA的发现，人们越来越重视这一新的调控层次，miRNA介导的转录后调控既可作用于转录因子直接参与调控过程，又可作用于某些功能蛋白作为转录调控的补充。

miRNA与造血有关的最初证据来自于Chen等的研究，他们从小鼠骨髓克隆了大约100个miRNA，发现其中三个（miR-223、miR-142、miR-181）主要表达于造血组织。进一步鉴定发现，miR-181于胸腺高表达，在未分化细胞（Lyn^-）低表达，在B淋巴细胞中表达上调。在造血祖细胞中异位表达miR-181，将这种细胞移植入致死照射的小鼠，会造成B系淋巴细胞比例的显著升高（较对照高53%）以及T细胞比例（Thy-1. 2⁺）的显著降低（88%）。随后的研究证实，不仅造血组织和非造血组织miRNA表达谱大不相同，在造血组织内部也存在差别。miRNA与造血干细胞向各系定向分化有关，并可能对分化起调控作用。

miRNAs参与造血分化和功能调节

淋巴细胞发育

研究发现在T细胞分化过程中，miR-181于胸腺高表达，并在胸腺CD4⁺CD8⁺双阳性细胞中表达上调。在这一发育阶段中miR-181a的上调与bcl-2、CD69和TCRα的表达呈负相关。进一步的研究表明，miR-181家族成员在胸腺发育中靶向bcl-2、CD69和TCRα调节其表达水平。由于CD69信号的破坏会影响淋巴细胞从胸腺的移出，异位表达的miR-181可能越过CD4⁺CD8⁺双阳性阶段，引起低表达CD69的细胞在胸腺中滞留，从而导致外周T细胞的减少。

miR-150选择性表达于成熟静息B细胞和T细胞，而在B、T祖细胞中不表达。过表达miR-150的转基因小鼠B细胞明显减少，表明miR-150通过靶向转录因子c-MYB调控B细胞分化。

miR-17～92基因簇也对B细胞发育至关重要。其在小鼠中的靶向缺失导致原凋亡蛋白Bim水平升高，抑制原B细胞向前B细胞的发育。这些证据表明miR-17～92基因簇在原B至前B细胞的发育转换中起特异性调节作用，通过靶向原凋亡蛋白Bim，促进这一阶段B细胞的存活。

miRNA与免疫系统

miRNA不仅在B、T淋巴细胞不同发育阶段具有不同的表达特征和调节功能，而且在调节免疫反应方面起重要作用（下表）。采用miR-155缺陷小鼠实验显示，miR-155调节生发中心功能、T细胞依赖抗体反应和细胞因子产生，对正常B、T细胞发挥功能至关重要。

参与免疫系统发育和功能调节的miRNA

进一步的实验揭示了miRNA在精确免疫调节中的作用。miR-181a可在发育过程中调控T淋巴细胞受体的敏感性。成熟T细胞中miR-181a表达升高增强T细胞对肽抗原的敏感性，而抑制不成熟T淋巴细胞中的miR-181a会降低其敏感性并破坏阳性和阴性选择。这些作用部分源于miR-181a对多种磷酸化酶（SHP-1、SHP-2、DUSP5和DUSP6）的多靶点调控，引起高水平磷酸化中间产物的积累，从而降低TCR信号的反应阈值。

巨核细胞与红细胞发育

在CD34⁺造血祖细胞（HPCs）向巨核系定向分化的同时伴有20种miRNA的下调。其中miR-10a和miR-130a可下调mafB和HOXA-1，而这两个基因均在此分化过程中上调，表明miRNA能够阻断它们的表达。在红系，CD34⁺HPCs向红系分化过程中出现miR-221和miR-222下调。这两种miRNA在CD34⁺HPCs中的异位表达抑制红细胞生长和Kit蛋白表达。进一步的实验揭示，miR-221和miR-222的下调可解除对kit表达的阻断作用，促进早幼红细胞的扩增。对红系前体细胞进行miRNA表达的系统分析显示了分化晚期miR-150、miR-155、miR-221和miR-222的进行性下调，miR-16、miR-451的上调，以及miR-339 和miR-378的双相调节。

采用条件GATA-1细胞系，Dore等发现miR-144/451基因簇处于红细胞关键调节因子GATA-1的转录调控之下。采用反义吗啉代寡聚体干扰斑马鱼胚胎中该miR基因簇的表达，发现注射miR-451反义寡聚体的胚胎有正常的红系前体，但向成熟红细胞的发育被破坏。注射miR-144反义寡聚体不引起任何明显改变。

粒细胞和单核细胞发育

研究发现，miR-223在CD34⁺HPCs和髓系前体细胞中低表达，随着粒细胞分化，其表达稳步增加，而在单核系中表达受抑。与此一致，miR-223在急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞系和患者标本用维A酸体外诱导粒系分化过程中表达上调。在寻找miR-223调节元件过程中，Fazi在miR-223前体-709碱基处发现了一个非保守的C/EBPa结合位点。采用APL细胞系进行的进一步实验表明C/EBPa与转录因子NFIA竞争结合这一位点。用维A酸处理APL细胞引起NFIA取代C/EBPa并导致miR-223的转录激活，miR-223的激活反过来抑制NFIA的转录。此外，在APL细胞中异位表达miR-223可以促进粒细胞分化。因此，从上述结果看，miR-223对粒系生成起正向调节作用。而其他研究组在小鼠和人的miR-223启动子位点的更远端发现了转录因子PU. 1和C/EBPb的结合位点，这两种转录因子与这一位点结合可激活miR-223的转录。并发现，APL细胞用维A酸诱导分化过程中抑制PU. 1可强烈抑制miR-223表达，因此认为在这一模型中，miR-223的表达主要由PU. 1驱动。但是，Johnnidis发现miR-223缺陷小鼠循环以及骨髓中性粒细胞的数量显著增加，这些粒细胞形态异常，粒系表面标志表达异常，并对刺激信号反应性增强，出现自发性炎性肺病。此外，他们还发现，促进髓系祖细胞分化的转录因子MEF2c是miR-223的靶点，剔除Mef2c基因后，miR-223缺陷小鼠表型恢复正常。因此，认为miR-223的作用是减少粒细胞产生并破坏其激活。总之，有关miR-223在粒系生成中的作用尚存争议。

在单核细胞发育中，PU. 1激活miR-424，在急性髓系白血病（AML）细胞系和CD34⁺HPCs中，激活的miR-424通过抑制转录因子NFIA反过来诱导单核/巨噬分化。

miRNA在不同的造血细胞分化阶段表达不同可能是由于miRNA转录生成pri-miRNA时受到特异性调控细胞分化的转录因子调节，也可能是miRNA在转录后调控某些系列特异基因的表达，参与造血分化决定。比较在造血分化过程中不同系列分化时转录因子及特异基因的变化，与相应的miRNA的变化相联系，再根据miRNA靶基因预测的结果和miRNA上游转录因子结合序列可能进一步揭示miRNA调控网络。

miRNAs与白血病

白血病是以异常血细胞增殖为特征的骨髓克隆性疾病。白血病患者中普遍存在非随机的染色体异常（如缺失、易位、倒位）导致的不可修复的基因功能缺失（如失去肿瘤抑制基因）或癌基因激活，上述因素一直被认为是导致白血病发生的关键。

慢性淋巴细胞白血病

在慢性淋巴细胞白血病（CLL），最为常见的染色体异常是13q14区的杂合或纯合或双染色体缺失，发生率超过50%，并与发病相关。miR15、16-1正好处于CLL基因缺失区13q14的30kb内。与健康供者正常成熟CD5⁺淋巴细胞相比，在大多数（68%）B淋巴细胞性白血病（B-CLL）患者的miR-15、16-1表达下调。在两例CLL患者白血病细胞中找到了引起等位基因缺失从而造成这两个miRNA基因簇表达沉默的相关突变。此外，在自然发生的迟发型性CLL小鼠模型中发现miR-16-1附近3' DNA的点突变导致miR-16-1表达降低。因此，不仅仅是染色体缺失，点突变也会引起CLL miR-15a/miR-16-1的表达降低。有趣的是，miR-15a/16-1的靶基因是癌基因bcl-2，原发性CLL患者中miR-15a/16-1的表达与bcl-2蛋白表达呈负相关。CLL恶性细胞大多过表达bcl-2，bcl-2本身具有抗凋亡作用，能够使肿瘤细胞逃避细胞凋亡。miR-15a和miR-16-1通过直接与bcl-2 mRNA的3'-UTR序列相互作用调控bcl-2蛋白的表达，以类似于抑癌基因的作用抑制B淋巴细胞的过度增殖，而它们的缺失则导致B细胞增殖能力大大增强，从而脱离正常的增殖凋亡平衡走向恶性转化的道路。体外实验证实miR-15a和miR-16-1在转录后水平抑制bcl-2的表达足以引起CLL来源细胞系的凋亡，因此，miR-15a和miR-16-1作为天然的bcl-2“抑制剂”有望应用于临床治疗CLL及其他bcl-2过表达引起的肿瘤。Calin等在一个家族性CLL并同时伴有乳腺癌的家系中鉴定出了miR-15a和miR-16-1基因的单核苷酸突变，该突变直接导致了miR-15a 和miR-16-1的表达下降，同时在75例CLL患者中的11个检出了同样的突变，因此，小RNA基因突变有望成为家族性CLL或其他癌症与CLL并发率的可能指标。

另外，两个在CLL发病中起关键作用的miRNA 是miR-29b和miR-181b。这些miRNA通过靶向调节TCL1发挥肿瘤抑制作用。TCL1是共激活AKT并参与调节细胞存活、增殖和死亡相关多条通路（如mTOR、NFκB、mdm2和cyclinD1通路）的癌基因。高水平的TCL1与ZAP-70以及非突变IgVH高表达相关，而后二者是侵袭性CLL的标志。转基因小鼠实验亦证实，TCL1能诱导IgV区重排，而IgV区重排正是CLL中侵袭性亚型的典型特征。

急性淋巴细胞白血病

到目前为止，急性淋巴细胞白血病（ALL）患者标本miRNA表达情况及功能的研究很少。Mi等发现了27个表达异常（6个上调，21个下调）并且在AML和ALL中有表达差异的miRNA。其中，miR-128b在ALL中的表达高于AML，并大大高于正常CD19⁺细胞。

急性髓系白血病

对240个具有中危至高危细胞遗传学异常的急性髓系白血病（AML）标本的miRNA表达进行分析，发现miRNA表达谱与FLT3-ITD相关，表明这类患者细胞遗传学异常可导致miRNA的表达。其中，miR-191和miR-199a的过表达与AML患者总体生存时间和无病生存时间呈负相关。

在对携带NPM1和FLT3-ITD突变的AML患者miRNA的功能研究中发现，这两类突变通常出现于正常核型的AML患者中，约占AML患者总数的30%～40%。其中NPM1突变患者miRNA表达谱与NPM1非突变者有明显不同，主要表现为前者有miR-10a、miR-10b以及let-7和miR-29家族成员的表达上调。表达下调的miRNAs中miR-204靶向调节HOXA10和MEIS1，表明NPM1突变的AML患者HOX表达上调可能部分源于调控HOX的miRNA的缺失。FLT3^-ITD⁺标本以miR-155上调为特征。进一步的实验证实，miR-155的上调不依赖于FLT3信号。给C56BL6小鼠移植过表达miR-155的小鼠HPCs，C57BL6小鼠骨髓出现伴有红系/巨核系减少的髓系增殖性疾病。这一结果与CD34⁺祖细胞向红系和巨核系分化过程中出现miR-155下调，以及在HPCs中过表达miR-155会阻断这两系体外分化这一现象相吻合。上述资料表明，miR-155阻断红系/巨核系分化，并与FLT3-ITD发病相关。由于miR-155的表达独立于FLT3信号，在治疗这一类型AML时应考虑用miR-155反义寡核苷酸阻断miR-155的同时联合使用FLT3-ITD抑制剂治疗。

在对APL细胞用维A酸（RA）诱导粒系分化过程中发现有miR-223特异性上调，而miR-181或miR-142表达水平未受影响。稳定过表达miR-223会促进RA反应性髓系白血病细胞系NB4向粒系分化，而干扰miR-223则抑制NB4对RA诱导分化作用的反应性，表明miR-223表达水平与髓系前体的分化密切相关。miR-223转录后调控对粒细胞分化以及APL白血病细胞对全反式维A酸的临床反应至关重要，为APL的诊断和治疗提供了新的靶点。

慢性粒细胞白血病

有研究表明，慢性粒细胞白血病（CML）细胞系中BCR-ABL和c-MYC均可以反式激活miR-17～92基因簇的上调。BCR-ABLMYC通路对pri-miR-17～92表达的诱导作用主要出现在慢粒慢性期的早期，而非急变期。

淋巴瘤

miR-155在很多人类肿瘤包括弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、原发性纵隔B淋巴瘤（PMBL）、Hodgkin淋巴瘤以及儿童Burkitt淋巴瘤（BL）中过表达，并发挥癌基因作用。在靶向B细胞过表达miR-155的转基因小鼠模型中，首先出现多克隆的前白血病前B细胞增殖，随后发生B细胞恶性肿瘤。miR-155在具有激活B细胞亚型中出现，而在幼稚B细胞亚型中不出现，而前者比后者的侵袭性强，因此miR-155可能成为DLBCL的临床诊断指标；在BL中miR-155的表达比正常人高出100倍，提示miR-155可能在BL的发生和发展过程中起作用，其机制可能是通过间接抑制某些抑癌基因的表达而实现。

13q31～32区的异常扩增在B细胞淋巴瘤患者中较为常见。而miR-17～92基因簇（包括miR-17-5 p、miR-17-3p、miR-18a、miR-19a、miR-20a、miR-19b-1 和miR-92-1基因）恰恰定位于这一区域，导致65% 的B细胞淋巴瘤患者miR-17～92表达水平明显增加。在MYC转基因小鼠的HPCs中过表达miR-17～92基因簇可以加速肿瘤形成。在淋巴细胞中过表达miR-17～92会使小鼠发生淋巴增殖性疾病、自身免疫以及成熟前死亡。miR-17～92基因簇通过下调PTEN和调节B细胞凋亡的原凋亡蛋白Bim促进淋巴细胞增殖和存活。深入研究发现，MYC可以结合并激活位于染色体13q31区域的miR-17～92的表达。此外，这一基因簇中两种miRNAs：miR-17-5p 和miR-20a可下调E2F1转录因子，而E2F1可促进细胞周期进展，是MYC的直接下游靶点。因此，MYC通过同时激活E2F1并通过基于miRNA的抑制机制限制其翻译，从而实现了对细胞增殖的紧密调控。

侵袭性淋巴细胞瘤白血病中常有t（8；17）染色体的异位，miR-142基因正好位于这个区域。异位使miR-142基因与c-Myc基因融合，导致c-Myc在miR-142基因启动子控制下高表达，促使低度恶性的慢性淋巴瘤演变为高度恶性的B细胞性白血病。

结语

最初在对秀丽线虫进行遗传筛选中发现的miRNA正引起越来越多的关注，成为人类遗传领域的新星。已有明确证据表明miRNA参与了造血细胞的发育和功能调控。miRNA精密调控造血细胞分化并调节细胞对刺激的反应性。其作用可能源于其对信号通路相关蛋白的多靶点协调抑制。在白血病和淋巴瘤，已发现广泛的miRNA调节异常。但是，完全阐明miRNA在造血和肿瘤中的作用还有大量工作要做。了解miRNA与转录体的相互作用，是阐明miRNA对基因表达的调控方式以及设计基于miRNA的治疗策略中重要的一环。