ELISA的基本原理及试剂(男科学 生殖激素的检查)

基本原理

将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，用酶标记的抗原或抗体与被固定的相应抗体或抗原发生特异性反应，反应在固相表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，加入酶底物及色原后显色。根据方法和步骤不同分为以下几种基本反应模式。

间接法

间接法是检测抗体最常用的方法。将特异性抗原包被于固相载体上，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质；加待测样本，其中的特异性抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物，洗弃未反应成分；加酶标记抗体，使在固相载体上形成抗原-待测抗体-标记抗体（或SPA）复合物；洗涤后，加酶底物或色原显色，在一定波长下测吸光度（A）值判定待测抗体的水平。

竞争法

用于检测待测样本中未知抗原或抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量成反比。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体；待测孔中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相抗体结合的机会，使酶标抗原与固相抗体的结合量减少；加底物显色，待测溶液抗原量越多，则被结合的酶标抗原量越少，呈色越浅。

双抗体或双抗原夹心法

将已知的特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质；加待测样本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让样本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物，洗涤除去其他未结合的物质；加酶标记特异性抗体，使在固相上形成包被抗体-待测抗原-酶标抗体复合物，彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中待测物质的量成正相关；加底物显色，夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

捕获法

血清中某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定，因此测定IgM抗体多用捕获法。将抗人IgM抗体包被于固相载体上，形成固相抗人IgM，洗涤；加入待测的人血清标本反应后，血清中的IgM抗体被固相抗体捕获，洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分；然后加入特异性抗原试剂，它只与固相上的特异性IgM结合，洗涤；再加入针对特异性的酶标抗体，使之与结合在固相上的抗原反应结合；洗涤后加酶底物及色原显色，在一定波长下测吸光度（A）值判定待测抗体的水平。

生物素-亲和素ELISA（ABS-ELISA）

亲和素是一种糖蛋白，每个分子由4个亚基组成，可以和4个生物素分子亲密结合。现在使用更多的是从链霉菌中提取的链霉亲和素。生物素又称维生素H，用化学方法制成的衍生物，生物素-羟基琥珀亚胺酯（BNHS）可与蛋白质、糖类和酶等多种类型的大小分子形成生物素的产物。亲和素与生物素的结合，虽不属免疫反应，但特异性强，亲和力大，两者一经结合就极为稳定。因此把亲和素和生物素与ELISA偶联起来，就可大大提高ELISA的敏感度。亲和素-生物素系统在ELISA中的应用有多种形式，既可用于间接包被，亦可用于终反应放大。

试剂

目前ELISA试验均有商品化的试剂盒，不需自己配制。试剂盒通常使用的试剂有以下几种。

一、标记用酶：目前常用的有辣根过氧化物酶（HRP）、碱性磷酸酶（AP）等，其中以HRP应用最广。

二、酶底物与色原：

1. HRP的底物：HRP的底物是H₂O₂或（过氧化脲），催化时需要供氢体参与，后者多为还原性染料，通过反应生成深色或有荧光的氧化性染料。HRP可用的色原（供氢体）很多，常用的供氢体有邻苯二胺（OPD）、四甲基联苯胺（TMB）等。
2. AP的底物：AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）作为底物，产物为黄色的对硝基苯酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于ELISA荧光测定，敏感度高于用显色底物的比色法。

三、洗涤液：Tris-HCl-Tween 20缓冲液：Tris 2.42g，1mol/L HCl 13ml，0.05%Tween 20，加蒸馏水至1000ml。

四、终止液：HRP反应终止液一般采用为2mol/L硫酸，AP用NaOH终止。