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对于细菌或真菌的纯培养物,基因组DNA的粗提的方法主要有哪些?(微生物 病原微生物的分子诊断)

导语:对于细菌或真菌的纯培养物,基因组DNA的粗提的方法主要有哪些?属于微生物下的病原微生物的分子诊断分支内容。本篇围绕微生物 对于细菌或真菌的纯培养物,基因组DNA的粗提的方法主要有哪些?主题,主要讲述核酸的分离和纯化,DNA等方面医学知识。

答:基因组DNA的粗提法仅适合于对基因组DNA完整性要求不高的分子生物学实验,如靶基因部分序列的分子检测与鉴定、耐药基因及耐药相关突变的检测等。粗提法提取细菌或真菌的基因组DNA,对于仪器、试验的要求较低,常用的方法主要有:

水煮法:即刮取少量菌苔于100μl ddH2O中,100℃煮沸10分钟,13 000rpm离心2分钟,基因组DNA即溶解在上清液中。水煮法的操作非常简便,缺点是纯度不够高,且对细胞壁较厚的革兰阳性菌的提取效果较差。

Chelex提取法:与水煮法步骤基本相似,只是以Chelex提取液替代ddH2O。Chelex提取液(100ml)的配制方法如下:5% Chelex 100 resin,100mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)10ml,10mol/L EDTA 1ml,1% Na3N 10ml,蛋白酶PK 50μg/ml,定容至100ml;其蛋白酶PK能裂解细菌的细胞壁成分,有助于革兰阳性菌基因组DNA的提取;Chelex 100 resin成分能吸附溶液中的蛋白成分,有利于提高DNA的纯度。

碱裂解法:碱裂解液的成分为0.5mol/L NaOH 与0.05mol/L枸橼酸钠,该方法可用于血培养液的细菌、真菌DNA的提取。挑取少量菌苔于1000μl碱裂解液或100μl血培养液于900μl碱裂解液中,静置5分钟以裂解细胞;13 000rpm离心2分钟,弃上清;加入等体积的Tis-HCl(0.5mol/L,pH 8.0)中和残余的碱液,13 000rpm离心2分钟,弃上清;加入100μl去离子水,13 000rpm离心2分钟,弃上清;重新加入100μl去离子水,13 000rpm离心2分钟,弃上清;加入100μl去离子水100℃干热10分钟;13 000rpm离心2分钟,上清液中含基因组DNA。

超声波法:用一定功率的超声波处理细胞悬液,使细胞急剧振荡破裂。对于大多数的细菌,可制备质量浓度为50~100mg/ml,在10~100kHz频率下处理10~15分钟,再结合水煮法以释出基因组DNA。

反复冻融法:将制备的细菌悬液在−20℃以下冷冻,室温或加热到更高的温度溶解,反复几次,以在细胞内形成冰粒,引起剩余细胞液盐浓度增高、细胞壁的溶涨,从而使细胞结构碎裂;后续步骤与水煮法同。反复冻融法可用于真菌DNA的提取。

液氮研磨法:利用液氮急速冷冻后细胞结构的固体化和脆性,在研钵内对组织或细胞进行研磨,以裂解细胞;后续步骤与水煮法同。液氮研磨法适合于器官、组织,以及真菌的基因组DNA的提取。