促凝辅因子：FⅤ、FⅧ、组织因子(血液病学 凝血因子生化与功能)

凝血系酶性复合物中的辅因子蛋白，分成血浆促凝辅因子前体蛋白和细胞跨膜蛋白两种。

FⅤ、FⅧ

两种可溶性血浆蛋白FⅤ和FⅧ在形成维生素K依赖性蛋白复合物中起辅因子作用。FⅧa和Ⅴa分别与FⅨa和FⅩa在膜表面结合而发挥辅因子功能，加速后二者的酶解速率。先天缺乏这些蛋白产生先天性出血素质。FⅤ缺乏症曾称副血友病，FⅧ缺乏症称为血友病A。患者的出血表现与先天性丝氨酸酶原蛋白FⅨ、FⅩ缺乏症等同。

FⅤ基因位于1号染色体长臂（1q21～25），FⅧ基因位于X染色体长臂（Xq28）。FⅤ及FⅧ基因长分别为80、180kb；mRNA为6. 8、9kb。两者的基因结构及氨基酸顺序十分同源。FⅤ含24个内含子，FⅧ25个。除FⅧ第6内含子外，两者的内含子-外显子交界区序列均相同，但FⅧ基因大于FⅤ。FⅧ基因是已知基因中最大者。图1简介FⅤ功能区，方框顶部箭头代表凝血酶的裂解位点（709，1018，1045），方框下的箭头代表被活化蛋白C （APC）灭活时裂解位点（306，506）。图2简介FⅧ功能区。方框上箭头指出凝血酶和FⅩa使FⅧ活化成FⅧa时的裂解位点。方框下箭头代表APC灭活时裂解位点。FⅤ及FⅧ分子自N端起的功能区都有2个A区、B区后有一个A区以及2个C区（名A1、A2、B、A3、C1、C2区）。B区两者很不相同且有种系差异。人和牛FⅤ的B区显著不同。两种蛋白B区都高度糖基化。FⅧB区含19个天门冬酰胺连有糖基，很不稳定，部分分子的B区有不同程度的裂解。B区功能不十分明了，但活化时能释放出活性肽，故该区可能与发挥辅因子活性有关。然而FⅤ活化过程中只当被凝血酶和FⅩa除去B区后才能参与酶-辅因子复合物的形成。两种蛋白A区都和铜蓝蛋白功能区高度同源。FⅤ及FⅧ分子存在单个铜离子提示它们可能具有氧化酶或过氧化物酶活性，这点尚未获证实。

血浆中FⅤ（Mr 330 000）由2196个氨基酸组成，半衰期0. 5天。FⅤ也存在于血小板α颗粒中，在血小板活化时被释出。血浆FⅤ水平20nM（5～10mg/L）以单链前体蛋白形式存在。牛主动脉内皮细胞、Hep G2（肝癌细胞株）和豚鼠巨核细胞都曾有合成FⅤ的报道。FⅤ精氨酸713、精氨酸1536位被凝血酶或FⅩa酶解，去除B区，即产生FⅤa及2个高度糖基化的活性肽。人FⅤa是异二聚体，重链（Mr 105 000）含A1A2及NH₂端，轻链（Mr 7400）含A3- C1- C2及羧基端。亚单位通过依赖二价金属离子的机制非共价联结。FⅤa无酶活性，作为辅因子在Ca²⁺存在下，形成膜磷脂-Ⅹa-Ⅴa复合物而加速FⅩa的催化能力。FⅤ和FⅤa与膜磷脂的结合本身不依赖Ca²⁺。FⅤ与丝氨酸磷脂有高亲和力而FⅤa的羧基端轻链（A3C2区）具有功能位点，能与血小板膜阴性磷脂特异结合。轻链还含有FⅩa、APC结合部位（受体），但FⅩa与FⅤa的相互反应同时需轻链和重链。FⅤa重链中有凝血酶原结合部位，是FⅤa起FⅩa辅因子功能的关键所在。FⅤa 轻-重链间二硫键见图3。FⅤ和FⅧ的许多半胱氨酸相同。FⅤ、FⅧ两者A区共同特征为都具有27个氨基酸，以二硫键桥形成a圈；此外，A1A2区含大的由二硫键桥组成的B圈；C区为由C1C2特大的两个二硫键圈组成。人和牛FⅤa的二硫键桥相等，人和牛FⅤa游离的半胱氨酸都在538、589、1953和2100位与蛋白功能有关。

图1　凝血因子Ⅴ功能区示意图

图2　凝血因子Ⅷ功能区示意图

图3　凝血因子Ⅴa重链和轻链

血浆中FⅧMr 285 000，血浆中FⅧ重链与大分子多聚体蛋白血管性血友病因子（vWF）联成二聚体使FⅧ分子获稳定。人FⅧ主要在肝内合成，血浆FⅧ由2332个氨基酸组成是由B- A3连接点及B区的不同程度酶解后形成的异二聚体，重链（Mr 90 000～200 000）含A1A2区或B区，轻链（Mr 80 000）含A3- C1- C2区。FⅧ被α凝血酶在精氨酸372位（A- A2连接点）、精氨酸740位（A2- B连接点）裂解；凝血酶并进一步裂解轻链精氨酸1648使释出vWF辅因子而产生FⅧa。FⅧa是异三聚体，由重链中A1区（Mr 50 000）A2区（Mr 40 000连带部分轻链）以及轻链A3C1C2区包括羧基端（Mr 74 000）所组成，三种亚单位以Me²⁺依赖的过程非共价结合。FⅧa一旦形成在溶液中很不稳定，主要是因为A2与其他区的联合较弱，A2亚单位解离伴FⅧa失活。

FⅤa和FⅧa可被活化蛋白C（APC）所灭活，A1A2区间裂解反应需在膜表面进行。APC一旦结合轻链2009～2018位APC结合部位，即能裂解FⅧa重链多个位点，精氨酸336（A1- A2连接点）、562（A2区内）、740（A2- B连接点），使FⅧa失活，先在A2区裂解能增强这一反应。

FⅤ、FⅧ蛋白合成后的修饰包括丝氨酸和苏氨酸糖基化和酪氨酸的硫化作用。FⅤ、FⅧ的磷酸化作用主要通过血小板衍生的蛋白激酶。

组织因子

组织因子（tissue factor，TF）是已知在血管损伤部位暴露出来的膜结合糖蛋白。TF是FⅦ的受体，血浆丝氨酸蛋白酶FⅦa的辅因子。TF和FⅦa两者需结合才能启动凝血瀑布反应。除血管壁组成中存在TF外，广泛分布于不同的组织细胞中如脑、肺、胎盘及白细胞。血液中的单核细胞和血管内皮细胞受多种细胞因子攻击下可诱生TF，使内皮完整的血管内由于细胞表达组织因子而促发凝血应答反应。12kb长的TF基因位于1号染色体、编码2. 3kb mRNA及复制蛋白质。人TF含263个氨基酸（Mr 45 000），有3个功能区：N端胞外区（219个氨基酸），跨膜区（或称疏水区23个氨基酸，220～242位）及胞内区（21个氨基酸，243～256位），245位含一个半胱氨酸以硫酯键与软脂酰基、硬脂酰基脂肪酸共价联结，使跨膜区获稳定。TF有许多可供N-和O-联结的位点，但糖基部位尚不清楚。

TF与FⅦa反应不需Ca²⁺，然而TF家族的辅因子功能需阴离子来增强，使FⅦa- TF复合物对底物水解的速率增强2个数量级。故认为FⅦa酶蛋白活性的表达需要和辅因子TF结合。阴离子膜的功能为加强维生素K依赖性底物与膜的结合因而增强TF- FⅦa对底物（FⅩ、FⅨ）的水解，而不是直接影响FⅦa- TF的催化能力。