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巨核细胞生成的调控(血液病学 巨核细胞的结构、发育、功能及其调节)

导语:巨核细胞生成的调控属于血液病学下的巨核细胞的结构、发育、功能及其调节分支内容。本篇围绕血液病学 巨核细胞生成的调控主题,主要讲述巨核细胞等方面医学知识。

巨核细胞造血的调控是在多水平、多层次、并有微环境参与的细胞因子正负调控的复杂网络。巨核细胞生成的调控指的是巨核细胞增殖分化和成熟的调节控制,它一方面受骨髓巨核细胞以及循环血中血小板数量和对血小板需求的影响,另一方面受体内巨核细胞生成调节因子水平的影响,包括生长刺激因子(正调节因子)和生长抑制因子(副调节因子)。

巨核细胞生成的正调控细胞因子

白细胞介素类细胞因子

这些因子单用或与其他细胞因子联用,能促进巨核细胞祖细胞集落形成。在体内,表现为增加巨核细胞数量,升高循环中血小板水平。

1)IL- 1α:由多种细胞产生,与IL- 3、IL-6和GM- CSF联用,可明显增强CFU- MK形成。给小鼠注射重组IL- 1α后,有升血小板和增加脾脏巨核细胞作用。IL- 1α可能通过基质细胞旁分泌协同作用影响巨核细胞造血,也有报道可直接作用于巨核细胞祖细胞。

2)IL- 3:主要由激活的T淋巴细胞产生,能促进小鼠HPP- CFU- MK、BFU- MK和CFU- MK的增殖。IL- 3与GM- CSF、IL- 1α、SCF联合或与IL-6、EPO联合,均能刺激人巨核细胞集落形成,并促进核内有丝分裂。给小鼠注射IL- 3,脾脏和肝脏的巨核细胞增多。

3)IL-6:是调控巨核细胞增殖分化的重要细胞因子。在巨核细胞祖细胞体外培养中,IL-6表现MK- CSA样和巨核细胞促进活力样效应,促进小鼠和人巨核细胞的发育、成熟,提高CFU- MK的产率,并刺激CD34+/HLA-DR-造血干细胞向CFU- MK定向发育。给小鼠注射rh- IL-6可促进巨核细胞数量增加和升高血小板水平。IL-6通过与巨核细胞表面IL-6受体的直接作用,以及通过骨髓基细胞-巨核细胞的紧密接触的相互作用,影响巨核细胞造血。

4)IL- 11:IL- 11的主要生物学效应是刺激B-淋巴细胞发育,增强IL-6依赖的浆细胞和骨髓瘤细胞增殖,刺激早期造血祖细胞增殖,刺激红系造血。其另一重要生物学效应是刺激巨核细胞系造血。IL- 11与SCF、IL- 3、GM- CSF联用,可促进CFUGEMM多系造血集落的生成;与EPO联用,促进BFU- E的生长。给狗肌注rhIL- 11,可使正常狗和全身照射狗的循环血小板数增加,狗骨髓中高倍体巨核细胞增加。说明IL- 11不仅是造血干细胞的协同因子,更是巨核细胞-血小板系造血的重要调控因子,IL- 11升高血小板的作用是特异性的。

5)IL- 12:给小鼠注射rhIL- 12出现血小板数下降但骨髓和脾脏巨核细胞造血增强,推测IL- 12可能通过其他细胞因子,如γ- IFN的介导发挥作用。IL- 12还刺激骨髓基质细胞产生IL-6、MK- CSA样多种细胞因子,通过旁分泌机制调节体内巨核细胞造血。IL- 12与SCF、IL- 3、GM- CSF、CSF- 1等造血因子协同,促进造血干细胞向巨核细胞祖细胞定向发育。

集落刺激因子类

GM- CSF、SCF、EPO、GCSF、和CSF- 1(M- CSF)作为协同因子,对巨核细胞造血都表现刺激性调节作用。

其他正调控因子

白血病抑制因子(LIF),PDGF,bFGF。

血小板生成刺激因子(TSF)样因子

1)血小板生成刺激因子(TSF):TSF与TPO在生理学、免疫学性质方面很相似。TSF在体内促进血小板形成、增加骨髓巨核细胞数量和扩充胞质、促进巨核细胞成熟。

2)巨核细胞刺激因子(MSF):其纯化物与TSF很相似,可能为一类蛋白质。MSF在体内和体外均表现刺激啮齿类动物原始巨核细胞DNA合成效应,并促进巨核细胞合成PF4样蛋白质。

3)巨核细胞潜在活力:是从WEHI细胞系培养上清中纯化的一种蛋白质,在体外刺激小鼠巨核细胞集落生长,生物学效应与TPO相似。

血小板生成素(TPO)

TPO是分子量36kDa的蛋白,基因位于人3q27- 28(小鼠:16)。它的受体由c- mp1基因编码,位于1p34(小鼠:4)。TPO由多种细胞产生,包括基质、脾脏、肾小管、肝脏、肌肉和脑细胞。肝细胞是血清TPO主要来源。TPO是巨核细胞生成和血小板形成的主要生理调节因子,是刺激巨核系祖细胞增殖和分化的作用最强的细胞因子。TPO在体外可以刺激巨核细胞各级祖细胞生长增殖,促进巨核细胞分化和增加血小板数量。TPO还可以启动成熟血小板受刺激后的活化反应。TPO又称巨核细胞生长和发育因子(MGDF),全程性调控。除了刺激巨核细胞生成,体外实验证明TPO单独或联合应用其他细胞因子,如GM- CSF,IL-3,IL-6,IL- 11,SCF,FMS样酪氨酸激酶配基,FGF和EPO可以扩增造血干细胞和巨核细胞祖细胞。

TPO对巨核细胞增殖作用的可能机制是:TPO 与c- mp1结合后,c- mp1二聚体化并引起酪氨酸磷酸化,Janus家族蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)活化,信号传导活化转录因子5(STAT5)、RAS、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)转录活化,通过STAT5、RAS通路作用于cyclin D1的表达,引起细胞增殖,PI3K- AKT及蛋白激酶C(PKC)通路参与TPO依赖的细胞增殖。TPO促巨核细胞的成熟作用主要与RAS/MAPK信号传导通路有关。此外,TPO可作用于造血干细胞,刺激造血干细胞的存活和增殖,加速其进入细胞周期。临床上,TPO可用于治疗放、化疗引起的血小板减少。

VIP

VIP(vasoactive intestinal peptide)是28个氨基酸的肽,广泛分布于哺乳动物组织中。VIP激活腺苷酸环化酶,可以诱导多种细胞的分化。VIP通过自分泌的途径作用于1型VIP受体(VPAC1)抑制巨核细胞的增殖和诱导血小板前体的形成。用VPAC1转染人巨核细胞白血病细胞系(CMK),可用定量PCR和免疫组化检测其表达。与对照组CMK细胞相比,VPAC1的上调使CMK/ VPAC1细胞增殖率降低(P = 0. 0003)而分化增强(P=0. 001)。

激素对巨核细胞造血的影响

胎盘催乳素样蛋白- E(PLP- E)

啮齿类在妊娠中巨核细胞造血增强和血小板水平升高。近年发现小鼠妊娠胎盘分泌的一种细胞因子PLP- E (placental hormone- like protein)通过gp- 130-依赖的信号传导通路刺激小鼠巨核细胞的分化和生长。PLP- E与TPO、SCF、Flt- 3L合用,可明显增强CFUGEMM、CFU- MK、BFU- E的扩增。

性激素

巨核细胞表面表达雌激素受体,表达量随着巨核细胞的分化而增加。雌激素对于血小板生成起着关键作用,体外实验证明雌激素增强人CD34+前体细胞向CD41+成熟巨核细胞的分化。小鼠体内实验显示应用大剂量雌激素(500μg/kg)对于小鼠骨髓中巨核细胞的数量影响具有双相效应,两天后,骨髓中巨核细胞数量明显增加,相应伴随有外周血中血小板数量的增加。免疫组化显示该剂量对于骨髓中CD61+原巨核细胞及CD34+前体细胞的比例无影响,提示雌激素可能不是通过促进骨髓中前体细胞的增生来增强巨核细胞的生成。相比较而言,低剂量但高于生理剂量的雌激素(100μg/kg)无初期的刺激效应,在应用5天后,骨髓中CD61+和CD34+的前体细胞比例明显减少,应用10天时,仍有前体细胞的减少,同时形态学和免疫组化显示成熟的CD41+巨核细胞数量明显减少。生理剂量的雌激素水平不影响巨核细胞的分化和活性。因此,在雌激素替代治疗时,为避免打破血小板生成的平衡,应该把握好剂量。

巨核细胞生成的负调控因子

抑制巨核细胞生成的因子主要来自血小板本身,如PF4、β-血小板球蛋白(β- TG)、TGF-β、TNF-α以及结缔组织激活肽(CTAP-Ⅲ)等。

(一)PF4

PF4在体外选择性抑制巨核细胞祖细胞生长,对CFU- MK、BFU- MK和CFU- Mix的抑制作用更明显,具有剂量依赖性和可逆性。不仅抑制巨核细胞祖细胞集落形成,还抑制巨核细胞分化成熟。PF4对巨核细胞的作用可能与其C-末端含有肝素结合位点有关。PF4、β- TG和CTAP-Ⅲ同属细胞因子趋化因子家族,都能结合肝素。研究表明,PF4、β- TG、CTAP-Ⅲ以及化学合成的PF4羧基端小肽(C1~24 和C13~24)在体外都能抑制巨核细胞集落形成。

实验表明,PF4对细胞增殖抑制作用的主要表现是将细胞阻滞于S期,这种作用是直接的、可逆的、有剂量依赖效应的。这种作用特征为PF4及其相关多肽在应用上提供了理论依据。两种最重要的应用是:①抗癌治疗中的骨髓造血干细胞以及巨核系祖细胞的保护作用。②造血干细胞的体外扩增。

在使用PF4扩增造血干细胞方面,我们发现经PF4孵育的骨髓或脐带血有核细胞结合细胞因子的细胞群数量增加,表达CD34的细胞也增加。将PF4与干细胞因子、IL- 3、GM- CSF等造血因子联合应用,可使造血干细胞体外扩增率明显增高,因此具有潜在的广阔应用前景。

(二)TGFβ

TGFβ具有广泛的细胞来源和多方面的生物活性,是一类结构相似、生物学性质相近的细胞因子的总称,包括至少5个亚型。研究最透彻的是TGFβ1,主要由巨核细胞和血小板产生。TGFβ的活性十分广泛,归纳起来至少有4个方面:①刺激成纤维细胞生长和细胞外基质的形成,促进创伤修复。②抑制造血细胞的生长,是生理性造血负调节的核心因子。③与白细胞介素及其他细胞因子共同作用,参与免疫和炎症反应。④在体外,抑制内皮、上皮、角质等多种正常细胞的增殖;在体内,则刺激血管形成。

TGFβ1是目前已知的最强有力的巨核细胞生成抑制剂,在皮摩尔(pmol)水平便有明显的抑制作用。TGFβ1在体外抑制小鼠和人的各级巨核细胞祖细胞,如HPP- CFU- MK、BFU- MK、CFU- MK集落形成。TGFβ1对其他造血干/祖细胞如CFU- S、CFUGEMM、BFU- E和CFU- GM的生长也有抑制作用,其作用并不限于巨核细胞系。这种抑制效应是直接地、特异地,并且具有可逆性和剂量依赖性。TGFβ1 和PDGF存在于巨核细胞和血小板的α-颗粒中。

(三)干扰素(IFN)和肿瘤坏死因子(TNF)

体外都表现抑制巨核细胞造血,rhIFN-α和rhIFN-γ联合抑制人骨髓巨核细胞祖细胞生长。IFN-α和IFN-γ用于治疗原发性血小板增多症成功的例子已有报道。

(四)其他能抑制巨核细胞生成的因子

包括:凝血酶、凝血酶敏感蛋白(TSP)、阿那格雷(anagreline)及Flt3/Flk- 2配体(FL)等。凝血酶也能抑制巨核细胞的增殖以及前血小板的形成。巨核细胞表面有凝血酶受体,凝血酶通过其受体起作用。TSP是血小板含量较高的蛋白,其他细胞也能合成。TSP能抑制巨核细胞集落形成。临床上发现阿那格雷能有效降低原发性血小板增多症的血小板数量,其作用机制为抑制巨核细胞的成熟。Flt3/ Flk- 2配体(FL)独自,或联合TPO作用,可以通过上调巨核祖细胞中bcl- 2和诱导p53的构象改变,从而抑制巨核细胞的发育成熟,并相应延缓巨核细胞的凋亡。p53蛋白是个构象可变的转录因子,在不同构象时,可以发挥促凋亡作用或抗凋亡作用。FL可以诱导p53构象发挥抗凋亡作用。

巨核细胞生成中的转录调节

目前巨核细胞的转录调节机制不是很明确。但许多转录因子已被识别。在巨核细胞生成中发挥重要作用的转录因子包括:GATA- 1、GATA- 2、FOG、NFE2、Ets家族、EKLF、RUNX1。其中,GATA- 1、FOG、NF- E2在巨核细胞生成中发挥关键作用。

GATA- 1

在多潜能造血干细胞终末分化的过程中,系特异性转录因子通过转录调节细胞种系发育。GATA家族蛋白包含两个高度保守的锌指结构域,其结构相同,均为Cys- X2- Cys;中间有17个氨基酸间隔,均为Cys- X2- Cys- X 17- Cys- X2- Cys结构。但这两个锌指的功能不同,羧基端与DNA结合,氨基端与其协同,增强结合的稳定和特异性。因子与GATA基序(motif)区的(A/T)GATA(A/G)DNA结合,通过两个锌指区调节靶基因而发挥作用。GATA结构普遍位于启动子,转录起始的上游或接近启动子的部位,有时可出现更复杂的排列,如紧密聚集或重叠出现。GATA转录因子家族包含6个成员,其在组织中分布不同而发挥不同的功能。在GATA家族中,至少有3个GATA因子(GATA- 1、GATA- 2、GATA- 3)在造血中有着重要的作用。在造血组织中,GATA- 1表达见于红系、巨核细胞系和肥大细胞系,是它们细胞生成中的主要调节分子。

GATA- 1缺失裸小鼠出现显著的血小板减少、巨核细胞增殖失调和胞质成熟障碍,说明GATA- 1是红系和巨核细胞系发育分化的中心调控因素。人GATA- 1点突变会造成血小板数量为正常的15%,血小板大小增加至少2倍,血小板形态是球形的而不是盘状,出血时间明显延长。这些结果均提示GATA- 1调节巨核细胞的生长、成熟和血小板的产生,GATA- 1是巨核细胞系发育分化的中心调控因素。

GATA- 2

存在于巨核细胞系和肥大细胞。GATA- 2在决定造血祖细胞定向分化过程中起重要作用。GATA-1和GATA- 2二者共同存在于巨核细胞中,共同调节巨核细胞的增殖与分化。

FOG(friend of GATA)

有多种核蛋白调节GATA- 1的生物学活性,如FOG、p300/CBP等。FOG- 1是与GATA- 1及GATA- 2相互作用的蛋白,包含998个氨基酸,含有9个锌指结构域。FOG- 1在红细胞、巨核细胞、肝脏和睾丸上表达。FOG- 1-/-鼠在胚胎发育期死于严重的贫血,部分红细胞有明显的成熟障碍,而发育为巨核细胞的红/巨核系祖细胞几乎完全障碍。FOG- 2包含1151个氨基酸,含有8个锌指结构,在心脏、神经和性腺组织表达。FOG- 2-/-鼠由于先天心脏损害死于胚胎期。FOG- 1是GATA- 1结合的联合因子,与GATA-1协同调节巨核细胞上的p45 NF- E2及GPⅡb启动子的表达,促进红系及巨核系的分化。FOG- 1在巨核细胞生成中可能有双重作用。在巨核细胞发育的早期,FOG- 1不需依赖GATA- 1即可以调节巨核细胞生成;在晚期,细胞成熟及血小板产生期依赖GATA- 1调节巨核细胞生成。

NF- E2在晚期巨核细胞生成及血小板生成中的作用

NF- E2最初是在红细胞上被识别的转录因子,正常情况下在巨核细胞、红细胞、杆状细胞及多潜能造血祖细胞表达。NF- E2是包含两个碱性亮氨酸锌指业单位的异二聚体[p45(称为p45 NF- E2)和p18]。NF- E2在晚期阶段巨核细胞生成(胞质成熟、颗粒生成)及血小板释放过程中起重要的作用。NF- E2-/-鼠循环中血小板严重降低而死于出血,巨核细胞增生异常,成熟阶段巨核细胞表现胞质成熟停滞,颗粒减少,以及分界膜系统的量和结构。血小板前身细胞及血小板明显减少,对血小板激活剂如凝血酶和TPA反应不灵敏。另外,巨核细胞上的血栓素合成酶(TXS)及血小板上的β1微管是p45 NFE2的靶基因,鼠TXS基因定位于NF- E2 cis元件,在p45 NF- E2缺失或小maf蛋白联合缺失时其表达降低。用阿司匹林(一种环氧酶抑制剂)在体外对血小板前体细胞的形成没有影响。

其他转录因子在巨核细胞生成中的作用

c- myb、AML1/CBFA2在造血干细胞向巨核细胞分化的过程中有重要的作用。其中AML1基因在家族血小板紊乱/易感急性髓系白血病(FPD/AML)患者中有变异。FPD/AML是常染色体显性遗传性疾病,单一AML1基因缺失可导致巨核细胞生成紊乱。从FPD/AML病人中取出的骨髓及外周血与正常人相比,巨核细胞克隆数目较少、个体较小。另外,病人血小板聚集缺陷,证实AML1调节血小板聚集功能。

Ets家族包含许多调节不同造血基因表达的转录因子,Ets蛋白控制巨核细胞特异性基因如cmp1、GPⅡb的表达,在巨核细胞生成中有重要的作用。Fli- 1(Friend’s leukemia integration- 1)是Ets家族原癌基因一员,位于人类11q24,表达于原始巨核细胞中。Fli- 1缺失的11. 5天的胚胎小鼠死于缺陷性巨核细胞生成,其他血液学异常和血管发育畸变。GATA- 1和Fli- 1在巨核细胞特异性基因启动子处结合可以增强基因表达和细胞分化。体外实验证实这两个蛋白协同作用,可以激活数种巨核细胞特异性基因的表达。Fli是巨核细胞生成过程早期和中期重要调节因子。

EKLF(Erythroid Krüppel- like factor)是个含有锌指结构的转录因子,在红系分化过程基因表达中发挥重要的正向调控作用,而在巨核系分化发育过程中发挥负向调控作用。在MEP后的巨核细胞中其表达下调。实验证明EKLF抑制巨核细胞分化的作用至少是通过抑制Fli- 1的表达。

HOX(homeobox)转录因子控制细胞的增殖和分化,是正常和疾病状态下造血的重要调节蛋白。体外实验显示,HOXA10基因对于造血干细胞的增殖有重要调节作用,其水平决定造血干细胞的分化命运。

HOXA10基因在巨核细胞上表达,其在鼠骨髓细胞中过量表达可选择性地扩增巨核系祖细胞。Thompson发现在两个巨核细胞血小板减少症的病人中HOXA11杂合子突变,目前HOXA11作用机制不清。