白血病细胞分化诱导剂(血液病学 血液肿瘤分子药理学)

对白血病细胞的诱导分化，最近已作为人类急性粒细胞白血病（AML）和骨髓增生异常综合征（MDS）的新疗法而进入临床研究阶段，这种使肿瘤细胞内诱导分化成正常成熟细胞的疗法，给人们提供一种可用较低毒药物，包括使用低于现在临床用的最大的耐受量化疗药，来控制白血病的希望。

迄今多数分化诱导剂的试验多是在体外用细胞株进行评价。常用的细胞株见下表。这些细胞株各代表白血病可能的表型，它们在体外都能终末分化。

分化诱导体外试验通常采用多指标判断。这些指标包括形态变化（如核质比变小、核仁消失）功能变化（如贴壁、吞噬、呼吸爆炸、生长曲线及细胞周期动力学和癌症基因表达的改变）、生化变化（如糖蛋白、核苷酸改变，DNA合成下降，血红蛋白生成增加，溶菌酶、非特异性酯酶、酸性磷酸酶活性增高）和膜的改变（如细胞表面抗原表达正常化，膜流动性、膜结合蛋白及其转动系统的改变等）。

分化诱导试验的细胞株

自Friend首次报道用二甲亚砜（DMSO）诱导鼠Friend红白血病细胞系分化以来，发现越来越多的物质均可作为白血病细胞分化诱导剂。Koeffler进一步把分化诱导剂分为生理性和非生理性诱导剂两大类。迄今已有十多种分化诱导剂进入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期临床试验。白血病细胞分化诱导剂包括化学结构各异的多种化合物，从最简单的平面型极性溶剂二甲亚砜，到结构复杂的抗生素；从生理活性激素和淋巴因子，到肿瘤启动因子都有。

临床现用的抗癌药至少有1/3对一种白血病细胞株有诱导活性。这些诱导剂中活性最强的是用于治疗AML的药物，如DNR、Ara-C和6-TG。一般来讲，有诱导活性的是抗代谢药（如Ara-C、MTX、6-MP）或天然产物（如VLB、抗生素），迄今尚未有烷化剂有诱导活性的报道。

有证据表明，这些诱导剂有特异的诱导分化的药理作用，而非细胞毒作用的结果。当把一些诱导剂在不同细胞株中进行诱导活性比较时，就可显示出特异的诱导分化作用。像放射菌素D在所有受试细胞中均呈诱导分化活性，相对来讲是罕见的。更常见的是像Ara-C诱导红系细胞MEL和K562，以及单核细胞M1、ML-1成熟化，但不诱导粒系细胞HL60和ML-1成熟化。类似结果可见于DNR和DXR。但维A酸似乎只对粒细胞分化成熟的细胞株有效。这些结果提示，诱导剂可以按其产生活性的白血病类型进行分类。而有些药物，如地塞米松可诱导M1细胞成熟，但对HL60则不能，而是增强其他诱导剂的活性；在MEL细胞，对其他诱导剂则有阻断作用。

就临床治疗对策来讲，这些效应多样性有重要意义。对某一药物诱导成熟分化作用的敏感程度不同，可能既反映白血病干细胞的突变性质，又反映细胞成熟程度。在患同一类型的白血病患者中，这种变异程度有待测定。如用VA或TPA处理患者的早幼粒细胞白血病细胞进行原代培养，则呈现相同的分化作用，但对其他ALL或ANLL患者的白血病细胞，其分化结果却不相同。相反，用Ara-C处理的ANLL细胞，分化结果却因人而异。因此，为患者选择有效药物就需精确区分出白血病细胞表型和进行诱导分化药敏试验，进行合理的个体化治疗。

诱导分化的作用机制

虽已对分化诱导剂的作用机制作了大量的研究，但迄今尚未完全明了。已知有活性的诱导剂的化学结构各式各样，是否存在统一终末分化途径尚不清楚。但有几种诱导剂，它们之间的构效关系在很多情况下是高度特异的，反映药物与特定受体的结合，如糖皮质激素、维生素D、维A酸RA及其代谢物。另外一些诱导剂如佛波酯（TPA）、VA和蒽环类，它们诱导细胞分化的活性是和它们在其他体系的生物活性，或对特异酶的抑制作用之间有很好的相关性。

定向分化（commitment）

一个迅速分裂的白血病细胞转化的终末分化的过程是复杂的，其中定向分化是很重要的一步，它代表细胞不可逆地过渡到终末分化的特性。虽然定向分化后的细胞能继续分裂，但其自我更新能力只限4～5代。HL60细胞自我更新能力的丢失，很明显先于细胞定向化。在随机定向前，细胞起码须接触诱导剂一段时间，这段时间称为迟发期（Lag period）。延迟时间的长短因细胞株而异。对MEL细胞接触DMSO必须的迟发期为12～24小时，对HL60接触DMSO或阿克拉霉素为12～48小时。过了这段时间撤去诱导剂，定向化了的细胞仍向终末分化。另一方面，若还不到需要的迟发期就撤去诱导剂，无论诱导剂的浓度多高，细胞仍不能分化。因此，提高诱导剂的浓度能增加迟发期完成后定向转化为终末分化细胞的百分率。同理，连接用诱导剂治疗的意义在于增加以前未定向分化细胞变为定向分化细胞的几率。

这些体外试验资料对设计临床治疗方案有积极意义。当然，治疗方案应使药物在整个迟发期能维持一个稳定的血药浓度范围。血浆中诱导剂浓度不足可导致降低分化出现程度，当其浓度低于某一阈值时，就不可能有分化治疗效果的出现。虽然细胞可中断药物接触，但只要细胞接触药物总的时间等于迟发期，就不会影响其转化为定向分化细胞的比例。在理想条件下，诱导剂应以最适合浓度连续作用于迟发期。显然，这样的用药方案设计，需要知道AML细胞的定向分化动力学和诱导剂的药代动力学。

定向分化的生物化学和分子生物学基础

诱导剂引发白血病细胞的生化变化及分子生物学变化列于下表。虽然可以合理地推测，并非某种生化变化，而是一系列变化的结果导致细胞定向分化，但也并非所有表7-3中所列变化都参与了。因此，区分与定向分化有关的生化变化与成熟化表达的变化，以及区分由于分化结果系列化变化与反映细胞周期和细胞分化差别就很重要了。

诱导剂处理的白血病细胞的变化

由于发现的第一类诱导剂是低分子量平面型极性溶剂。这些溶剂只有在较高浓度（0. 1mol）时才有活性。早期的研究发现，它们诱导分化中抑制活性与磷脂膜的转变温度相关。进一步研究显示，除修饰膜流动性能力外，有效诱导剂化学上属于Lewis碱，即有游离的电子对可以形成氢键。据此推测，诱导剂微扰膜的能力能改变膜的转运性质，或引起第二信使的释放。

用MEL细胞研究证实，用DMSO处理后，的确出现离子转运的变化。这提示钙离子转运速率是MEL细胞定向分化的限速步骤。DMSO由于抑制钠泵而增加钙的转运，细胞内钙离子增加可能活化或抑制一些酶系从而改变细胞内调节物质分子水平，最终影响基因表达而产生定向分化的细胞。然而迄今尚未有较明确的证据证明细胞定向分化与某一些生化变化相关。以后相继发现的新分化诱导剂，包括作用比DMSO强10⁸或具有特异受体的化合物都表明除了质膜以外，必须考虑其他作用点的存在。事实上，用5溴脱氧尿苷作诱导剂使HL60细胞分化，它的作用点，也就是它的受体已经证明是DNA。

对癌基因特别是c-myc在白血病细胞分化作用已有较深入研究。在许多生物系统中，细胞增殖或分化状态改变，c-myc表达都有异常变化。在K562、MEL和HL60细胞分化早期，都可出现c-myc表达降低和c-myc转化（turnover）的改变。在加入诱导剂DMSO，次黄嘌呤或己次甲基双乙酰胺于MEL细胞，c-myc转录水平在1～2小时内下降10倍，在接触诱导剂8～24小时这段时间，c-myc又暂时回到处理前表达水平，当细胞分化时c-myc水平又再下降。用含有c-myc融合于病毒启动子的质粒转染MEL细胞研究c-myc异常双相表达时，转染的外源myc基因抑制MEL细胞分化，而在某些情况下则是完全阻断。这表明c-myc在开始的下降对细胞定向分化是至关重要的，相似地用含有c-myc正义（sense）或反义序列重组质粒转染细胞效果却不一样。用正义序列转染的细胞开始myc表达降低，但又迅速恢复，并迅速向红系定向成熟。与此相反，用反义myc转染的细胞，则显示在c-myc表达和分化的延迟。因此，证实c-myc在MEL细胞分化的调节作用。然而c-myc表达这种双向变化在细胞定向分化的真正意义还不完全明了。

从临床观点来看，了解诱导剂作用机制对患者合理使用诱导剂相信会有很大的帮助。

ATRA

维A酸受体RAR是核受体家族之一。这类受体共同特征是它们能结合在DNA调节区域称为靶序列（target sequence）或激素反应元件（hormone response elements，HREs）上，并且以依赖配体方式活化基因转录。RAR是与RXR的异二聚体（heterodimer）与DNA的有义序列（consensus sequence）AGGTCA五个核苷酸结合。RAR-RXR结合一分子全反式维A酸和一分子顺式维A酸（all trans RA和9-cis RA）。还有证据证实无激素的受体能抑制基因的转录。在这些核受体中有几个结构区已经被鉴定清楚，这些蛋白生物的活性是由它们产生的。这些受体与DNA相互作用是通过一个保守的DNA结合区（C），它含有两个锌指（zinc finger）基序（motif），而它们是由含有几个与锌原子配位纵轴排列重复的半胱氨酸残基组成的。C区允许核受体紧密地结合到DNA反应元件上。配体结合在受体羧基端，一个清楚定义配体结合区（E）上。在此辖区不仅有结合配体的序列还有与核转位，二聚体化，转化作用和热休克蛋白相互作用序列。F和D区的功能未知；虽然在铰链区（hinge domain）D至少有两个特异区域的序列存在。核受体是以二聚体与DNA结合的，而且在DNA和配体结合区的二聚化界面已经阐明。对RAR，合适的二聚体是与RXR组成的二聚体。t-RA结合在RAR上，RXR参与维A酸的信号传递是通过直接与t-RA的代谢物9-cis RA相互作用。

RAR有三个亚型，RARα、RARβ和RARγ组成。在人类和啮齿动物等都发现这些亚型的存在。人类RAR在它们的DNA和配体结合区之间的同源性很高。RAR与一些肿瘤细胞的发生及分化有密切关系，绝大多数急性早幼粒细胞白血病（APL）的患者伴有RARα亚型结构改变，这种改变是由于染色体移位t（15；17），产生融合蛋白PML-RARα。PMLRAR能够对RAR、RXR和PML功能在维A酸存在或不存在情况下发挥决定性负面癌基因作用。与RARα不同，PML-RARα在溶液中是以稳定的二聚体存在，PML部分是缔合作用稳定化的根源。与RARα不同，PML-RARα并不需要RXR参与与DNA靶序（即RARE）有效结合，这就可以部分地解释PML-RARα均二聚体（homodimer）改变RARα由RARE介导转录活性的能力。然而，PML-RARα均二聚体显示与DNA结合的倾向是明显不同于RARRXR异二聚体的、增加RXR浓度能把反应元件移到更适合于RAR-RXR异二聚体结合。意外的是这后一种情况的出现并没有PML-RAR均二聚体离解，而导致含有一个或两个RXR分子的三聚体和四聚体形成。PML-RAR而非RAR对RXR定位起到决定性的影响，这种影响可以通过加进维A酸而得到克服。这就提示PML-RAR能够抑制许多牵涉到RXR异二聚体的基因通路，包括RAR介导的通路。因此，维A酸治疗可以翻转早幼粒细胞分化受到的阻断，通过克服PML-RARα对PML分布和RXR的定位的决定性影响而使疾病缓解。结果，RXR的异二聚体（PML-RAR/RXR和RAR/RXR）可能影响配体介导的涉及分化的关键DNA靶序的转录。概括起来，这些证据说明疾病的缓解需要相对高的t-RA药物浓度才能发挥作用。